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.2013年5月28日；6（277）:ra39。
doi:10.1126/scisional.2003374。

腺苷介导的信号通路抑制GTPase Rap1B的丙烯基化并促进细胞散射

伊丽莎白·恩坦蒂 1, 帕特里克·冈约, 埃伦·洛里默, 安德鲁·德·豪泽, 内森·舒尔德, 唐娜·麦卡利斯特, 巴拉拉曼·卡利亚纳拉曼, 迈克尔·德温内尔, 约翰·A·奥尚帕奇, 卡罗尔·威廉姆斯
附属公司

腺苷介导的信号通路抑制GTPase Rap1B的丙烯基化并促进细胞散射

伊丽莎白·恩坦蒂等。 科学信号. .

摘要

在转移过程中，癌细胞获得了相互分离和迁移的能力，这在体外被重新描述为细胞散射。小鸟嘌呤三磷酸酶（GTPase）Rap1通过促进细胞间粘附来对抗细胞散射，这是一种需要其丙烯基化的功能，或用羧基末端类异戊二烯部分进行翻译后修饰，以使其能够在细胞膜上定位。因此，调节Rap1的异戊二烯化的信号级联提供了控制Rap1的膜定位的机制。我们确定了一种由腺苷A2B受体启动的信号级联，通过磷酸化Rap1B抑制Rap1B的丙烯基化，从而减少其与伴侣蛋白SmgGDS（小GTPase鸟苷二磷酸离解刺激物）的相互作用。这些事件促进了非戊烯基化Rap1B的细胞溶质和核积累，减少了细胞间粘附，导致细胞散射。我们发现，非戊烯化Rap1在大鼠乳腺肿瘤中比在正常乳腺组织中更为丰富，腺苷受体的激活延迟了乳腺、肺、，胰腺癌细胞系。我们的研究结果支持这样一种模型，即高浓度的细胞外腺苷，如肿瘤微环境中产生的腺苷，可以长期激活A2B受体，抑制Rap1B丙基化和细胞膜上的信号传递，从而减少细胞间接触并促进细胞散射。抑制A2B受体可能是预防转移的有效方法。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
腺苷受体激活诱导Rap1B磷酸化。(A类)图中显示了Rap1B磷酸化和丙氨酸化突变体的C末端序列。(B)磷酸化图像中可检测到Rap1B的磷酸化(顶部)是由免疫印迹产生的(底部)myc标记的Rap1B蛋白32经或不经NECA处理的P标记HEK293T细胞。免疫印迹(底部)表明免疫沉淀myc-Rap1B蛋白的不同迁移率。星号表示分子量标记的迁移（np=非戊基化Rap1B，p=戊基化的Rap1B）。(C类)Rap1B磷酸化的倍数增加是通过测量在以下实验中生成的磷酸化图像中检测到的蛋白质外径来确定的：B。这些值表示为相对于未处理细胞中指示蛋白质外径的倍数增加，是三个独立实验的平均+/-SEM。学生t检验用于统计分析。星号表示在磷酸化图像中未检测到myc标记的Rap1B（AA）和Rap1B（EE）蛋白的磷酸化形式。
图2
图2
Rap1B的丙烯基化因磷酸模拟突变和NECA或6-Bnz-cAMP治疗而减少。(A类)瞬时表达不同myc-tagged Rap1B蛋白的HEK293T细胞经过TX-114分馏，生成含有非壬基化（np）蛋白的水相“A”和含有戊二醛化（p）蛋白的洗涤剂相“D”。用myc抗体对细胞组分进行免疫印迹，以检测myc标记的Rap1B蛋白和GAPDH抗体，以确认蛋白质载量相等。TX-114组分下方显示了总细胞裂解物的免疫印迹。结果代表了三个独立的实验。(B-D公司)瞬时表达不同myc标记的Rap1B蛋白的HEK293T细胞在加入或不加入NECA（10μM）的情况下处理24小时(B)，6-Bnz-cAMP（1 mM）(C类)，或8-CPT-cAMP（30μM）(D类). 细胞进行TX-114分离和免疫印迹，如A类.使用来自水相和洗涤剂相的免疫印迹蛋白质的外径值来计算戊二醛化Rap1B的百分比。数值是通过四个数值计算得出的平均值+/-SEM(B)，五个(C类)、和三个(D类)独立实验。通过配对Student t检验和Bonferroni调整的p值确定统计显著性（*，p<0.05）。代表性免疫印迹如图S2所示。
图3
图3
磷酸化突变或NECA治疗减缓了Rap1B的戊二醛化，但KT5720治疗加速了Rap1的戊二酸化。未转染的HEK293T细胞(A类)或表达myc标记的Rap1B蛋白的HEK293T细胞(B)用美伐他汀孵育，清洗，并置于有或无NECA的培养基中。在指定时间对细胞进行TX-114分离，然后使用Rap1B抗体进行免疫印迹检测内源性Rap1B(A类)或myc抗体检测myc标记的Rap1B蛋白(B). 对免疫印迹水和洗涤剂组分中的蛋白质进行密度测定，以计算戊基化Rap1B的组分。在每个图中，结果是三个独立实验的密度分析的平均值+/-SEM。(C、 D类)用美伐他汀孵育HEK293T细胞，洗涤，用或不用KT5720或NECA孵育指定时间，裂解并用Rap1B抗体免疫印迹。通过对免疫印迹中检测到的缓慢迁移的非戊基化Rap1B和快速迁移的戊基化Rap1B进行密度分析，计算出戊基化的Rap1B的比例。在每个图中，结果是两个独立实验的密度分析。代表性免疫印迹如图S4所示。
图4
图4
Rap1B的磷酸化减少了其与SmgGDS-607的相互作用。(A类)将来自HEK293T细胞的HA免疫沉淀物与HA标记的SmgGDS-607、myc标记的Rap1B或Rap1B-Saax以及总细胞裂解物共同用HA和myc抗体进行免疫印迹。(B)类似于A类，但用编码myc标记的Rap1B磷酸化突变体的cDNA转染细胞。(C类)网织红细胞裂解物用于在体外要生成的转录和翻译分析35S标记的SmgGDS-607-HA和35S标记的myc标记的Rap1B或显性阴性（DN）S17N Rap1B。这个35在没有或存在6-Bnz-cAMP的情况下，将S标记蛋白一起孵育。对来自体外试验的HA免疫沉淀物进行放射自显影。使用DN-Rap1B是因为它与SmgGDS-607形成比野生型Rap1B更稳定的复合物（15）。所有结果都代表了至少四个独立实验。
图5
图5
Rap1B的磷酸化促进其在细胞质和细胞核中的积累。(A类)用6-Bnz-cAMP、NECA或非药物处理表达GFP标记的野生型或突变型Rap1B蛋白的HEK293T细胞，并用共焦显微镜成像。所有图像都具有相同的放大倍数，代表了三个独立的实验。右下角的比例尺代表10μm。(B)用编码GFP-Rap1B的cDNA转染HEK293T细胞，并在KT5720存在或不存在的情况下用NECA处理。通过荧光显微镜收集细胞图像，并对编码图像进行评分，以确定GFP-Rap1B的膜定位，如图S5所示。结果是来自三个独立实验的平均+/-SEM。列上方的值（n）表示得分单元格的数量。通过重复测量ANOVA和二次Dunnett多重比较试验确定药物处理细胞与未处理细胞之间的统计差异。(C类)对表达所示myc标记的Rap1B蛋白的HEK293T细胞进行裂解，并使用下拉试验测量GTP-结合的Rap1 B的数量。如图右侧列出的时间所示，显示了免疫印迹的多次暴露。图S6显示了三个独立实验的免疫印迹密度分析。
图6
图6
腺苷受体的激活促进细胞散射，这是一种被磷酸缺乏型Rap1B（AA）表达抑制的反应。(A类)在使用或不使用NECA、6-Bnz-cAMP或8-CPT-cAMP治疗后，收集HEK293T细胞的合并亮场和DAPI图像。(B)中所述细胞的形态分析A类如图S7所示进行。结果是两个独立实验的平均+/-SEM，每个样本中有13–24个菌落得分。使用单因素方差分析（ANOVA）和二次Dunnett多重比较试验来确定药物处理细胞与未处理细胞之间的显著差异。(C类)在收集荧光图像之前，将表达GFP或GFP标记的野生型或突变型Rap1B蛋白的HEK293T细胞与NECA一起培养或不与NECA一同培养。对编码图像进行分析，以确定每个细胞接触的邻居数量，如图S8所示。细胞的代表性图像如图S8所示。结果是两个独立实验的平均+/-SEM，每个样本中有18–21个菌落（代表113–165个细胞）。使用配对Student t检验和Bonferonni调整的p值对括号内的样本进行统计分析。
图7
图7
腺苷信号传导减缓多种细胞类型中的Rap1B丙氨酸化。(A类)我们的腺苷调节Rap1B的模型。在缺乏腺苷信号的情况下，新合成的Rap1B与SmgGDS-607相互作用，从而促进丙烯基化。预酰化Rap1B定位于质膜，促进细胞间粘附。当A2BR被激活时，PKA介导的Rap1B磷酸化减少了其与SmgGDS-607的相互作用，从而减缓了Rap1B-丙基化。非苯基化Rap1B积聚在胞浆和细胞核中，导致Rap1B在质膜上的功能丧失，促进细胞接触的溶解和细胞散射的启动(B)将肺癌细胞株（NCI-H1703，NCI-H23）、乳腺癌细胞株（MCF-7，MDA-MB-231）和胰腺癌细胞系（PANC-1，MiaPaCa-2）与美伐他汀共同孵育、清洗，并与NECA或不与NECA一起孵育。在指定的时间，对细胞裂解物进行免疫印迹以检测内源性Rap1B。通过对免疫印迹中检测到的缓慢迁移的非戊基化Rap1B和快速迁移的戊基化Rap1B进行密度分析，计算出戊基化的Rap1B的比例。结果是所有细胞系（NCI-H23细胞除外）的3-5个独立实验（如每个图表所示）免疫印迹密度分析的平均+/-SEM。通过两个独立实验的免疫印迹密度分析获得NCI-H23细胞的结果。代表性免疫印迹如图S9所示。(C类)使用检测非肾素化Rap1、总Rap1或肌动蛋白的抗体，对从DMBA处理的大鼠的乳腺肿瘤“T”或正常乳腺组织“N”中制备的细胞裂解物进行免疫印迹，以确认负载量相等。
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