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.2013年8月；9（8）：1228-43。
doi:10.4161/auto.24893。 Epub 2013年5月21日。

β-肾上腺素能受体刺激的脂解需要RAB7介导的自溶体脂质降解

阿利安·利萨索 1, Kien Thiam Tan先生, 李英惠
附属机构

β-肾上腺素能受体刺激的脂解需要RAB7介导的自溶体脂质降解

阿利安·利萨索等。 自噬. 2013年8月.

摘要

激素刺激的脂肪分解是一种从储存库中快速动员脂肪用于外周组织的方法。按照惯例，通过β-肾上腺素能受体（ADRB2）-cAMP信号通路激活胞浆脂肪酶是被认为从细胞脂滴（LD）中储存的甘油三酯中释放脂肪酸的唯一分子机制。在此，我们提供证据表明，除了细胞溶质脂肪酶的激活外，自噬还有助于这种激素刺激的脂解。使用药物抑制剂或shRNA-介导的自噬基因敲除抑制早期或晚期自噬后，ADRB2刺激的脂解减少。ADRB2刺激导致溶酶体降解的自噬靶向LD显著增加，这依赖于LD相关的RAB7，如shRNA-介导RAB7敲除和显性阴性RAB7突变体的使用所证明的。此外，RAB7参与非刺激性（基础）脂肪分解，并介导PLIN1/紫苏素1敲除脂肪细胞中增强的基础脂肪分解。总之，我们的结果表明，脂类吞噬对基础和激素刺激的脂解都有贡献，并且RAB7在调节这种自溶体介导的脂肪细胞中的脂质降解中起着关键作用。

关键词：3T3-L1；RAB7；自溶体介导的脂质降解；脂肪分解；吞噬脂类。

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数字

无
图1。RAB7在ADRB2刺激的LIPE诱导的脂肪细胞依赖性脂解中是必需的。(A类)ADRB2激动剂刺激的3T3-L1脂肪细胞甘油释放减少拉布7击倒细胞。左上角，内源性RAB7的免疫印迹以确认敲除效率。底纹是ACTB表达和Ponceau S染色的印迹。右上角，慢病毒转导细胞在基础和刺激条件下的细胞内甘油三酯含量。细胞内甘油三酯（mg甘油/mg蛋白质）吕克和sh拉布7对照条件分别为0.22和0.21，而异丙肾上腺素刺激分别为0.12和0.17。底板，甘油释放控制（sh吕克)或拉布7（sh）拉布7)在基础或刺激条件下用异丙肾上腺素或8-Br-cAMP击倒脂肪细胞。sh的甘油释放量（mg甘油/mg蛋白质）吕克和sh拉布7对照条件分别为0.22和0.16，而异丙肾上腺素刺激分别为0.39和0.33，8-Br-cAMP分别为0.62和0.44。数据表示平均值±SD，n=4*p<0.001与sh吕克相同条件下处理，t检验。(B类)击倒拉布7在异丙肾上腺素刺激下，不影响PLIN1、PNPLA2和LIPE的表达和激活。基底细胞和ADRB2刺激细胞裂解物的免疫印迹吕克和拉布7用RAB7、磷酸-LIPE（Ser563）和总LIPE、PNPLA2和PLIN1击倒脂肪细胞。底纹是ACTB表达和Ponceau S染色的印迹。(C类)敲除RAB7不会影响LIPE与LD的共定位。与CFP-PLIN2表达载体共转染并接受异丙肾上腺素治疗30分钟的固定脂肪细胞内源性磷酸-LIPE免疫染色。用Hoechst 33342对细胞核进行复染。箭头表示LD的示例。(D类)ADRB2激活增加RAB7对LD的定位。在基础和异丙肾上腺素刺激下表达YFP-RAB7和CFP-PLIN1融合蛋白的3T3-L1脂肪细胞的实时图像。右侧面板是对应左侧面板中装箱区域的放大图像。黄色表示同位化。箭头表示同位化示例（黄色）。N、 核心。
无
图2。抑制自噬和溶酶体活性可减少ADRB2刺激的3T3-L1脂肪细胞的脂肪分解。(A类)3-甲基腺嘌呤（3-MA）和氯喹（CQ）减少ADRB2激动剂刺激的脂肪细胞甘油释放。用10 mM 3-MA、50μM CQ或氯化铵/亮氨酸蛋白酶（NH）预处理4 h的细胞的甘油释放4Cl/leu，20 mM/100μM）持续1小时，然后用异丙肾上腺素或8-Br-cAMP刺激。然后将每个处理的甘油释放量与对照条件下的载体处理（设为1）进行比较，并计算为相对甘油释放量。载体、3MA、CQ和NH的甘油释放量（单位：mg甘油/mg蛋白质）4对照条件下的Cl分别为0.13、0.07、0.06和0.08，而异丙肾上腺素刺激分别为0.41、0.26、0.19和0.26，8-Br-cAMP分别为0.45、0.25、0.21和0.31。数据表示平均值±SD，n=4*与相同条件下的车辆相比，p<0.001，t检验。(B类)药物治疗不会影响LIPE在异丙肾上腺素刺激下的表达和激活。用3-MA或CQ处理并随后用异丙肾上腺素（ISO）刺激15分钟的细胞裂解物的磷酸化-LIPE（Ser563）和总LIPE的免疫印迹。底线是ACTB表达和印迹的Ponceau S染色(C类). (D类)击倒附件5或灯1/2基因损害异丙肾上腺素刺激的脂肪分解。sh的甘油释放附件5慢病毒在基础和异丙肾上腺素刺激的条件下转导脂肪细胞。然后将每个处理的甘油释放量与sh的甘油释放总量进行比较吕克在控制条件下处理（设为1），并计算为相对甘油释放。sh的甘油释放量（mg甘油/mg蛋白质）吕克，什附件5第页灯1，什灯2和sh灯1/2对照条件分别为0.09、0.051、0.049和0.043，而异丙肾上腺素刺激分别为0.44、0.34、0.34,0.33。数据表示平均值±SD，n=4*与sh相比p<0.01吕克在相同条件下，进行t检验。(E类)击倒附件5或灯1基因不影响胞浆脂肪酶的表达和激活。用携带sh的慢病毒转导的脂肪细胞裂解物的磷酸-LIPE（Ser563）、LIPE、PNPLA2和PLIN1的免疫印迹附件5或sh灯1底纹是ACTB的表达和印迹的Ponceau S染色。
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图3。ADRB2激活促进3T3-L1脂肪细胞中的自溶体形成。(A类)ADRB2激动剂刺激脂化LC3B的降解。用异丙肾上腺素或8-Br-cAMP刺激脂肪细胞在指定时间内的裂解产物的LC3B免疫印迹。底纹是ACTB表达和Ponceau S染色的印迹。(B类)氯喹（CQ）抑制ADRB2激动剂刺激的脂化LC3B降解。用50μM CQ预处理脂肪细胞裂解物的LC3B进行免疫印迹，然后在无CQ（载体）或持续存在CQ的情况下进行ADRB2激动剂治疗。底线是ACTB表达和印迹的Ponceau S染色。(C类)ADRB2刺激后GFP和RFP穿孔动态变化的时间推移图像。在异丙肾上腺素治疗前，用mRFP-GFP-LC3B表达载体转染脂肪细胞。GFP公司+招标书+和GFP−招标书+分别代表自噬体和自溶体。N、 核心。(D类)CQ抑制ADRB2激动剂刺激的GFP交换+招标书+带GFP−招标书+LC3B。转染mRFP-GFP-LC3B表达载体的固定脂肪细胞的图像，在没有（载体）或存在CQ的情况下用异丙肾上腺素处理。用Hoechst 33342对细胞核进行复染。(E类)ADRB2激动剂增强自噬体和溶酶体的共定位。用GFP-LC3B表达载体转染的脂肪细胞中内源性LAMP1的免疫染色。用Hoechst 33342对细胞核进行复染。底部面板是从相应的上部面板放大的装箱区域视图。箭头表示共同定位的示例（黄色）。使用MetaMorph软件计算共定位量化，如图S3C所示。
无
图4。ADRB2激活增加3T3-L1脂肪细胞中的自溶体靶向LDs。(A类)ADRB2激动剂增加内源性LC3B和LDs的共定位。在预加载BODIPY 500/510，然后用异丙肾上腺素刺激的固定细胞中对内源性LC3B进行免疫染色。用Hoechst 33342对细胞核进行复染。底部面板是从相应的上部面板放大的装箱区域视图。箭头表示LD与LC3B的同位化示例（黄色）。计算共定位量化，如图S4A所示。(B类)仅转染GFP-PLIN1或GFP-PLIN1和RFP-LC3B表达载体的细胞在异丙肾上腺素刺激前后的实时图像。仅转染GFP-PLIN1的细胞在异丙肾上腺素刺激前预加载LysoTracker Red。每组中的右侧面板是对应左侧面板中装箱区域的放大视图。各组箭头表示异丙肾上腺素治疗前后的LD相同。(C类)ADRB2激动剂刺激LD定位到晚期内体或溶酶体室。在预加载BODIPY 500/510，然后用异丙肾上腺素刺激的固定细胞中对内源性LAMP1进行免疫染色。用Hoechst 33342对细胞核进行复染。底部面板是从相应的上部面板放大的装箱区域视图。箭头表示同位化示例（黄色）。计算共定位量化，如图S4C所示。(D类)对照组和ADRB2刺激的3T3-L1脂肪细胞的TEM显微照片。星号（*）表示LD。白色箭头表示含有LD的自噬液泡。黑色箭头表示自噬液泡。N、 细胞核；mt，线粒体。右侧面板，每100µm自噬空泡数量的定量2对照细胞和异丙肾上腺素处理细胞的细胞切片细胞质面积。数据表示平均值±SD，n=24。
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图5。ADRB2激活增加了LDs与RAB7和3T3-L1脂肪细胞中自溶体成分的关联。(A类)ADRB2激动剂刺激RAB7与自噬体靶向LDs的共定位。用GFP-RAB7、RFP-LC3B和CFP-PLIN1表达载体共转染细胞，并用异丙肾上腺素处理1h。底部面板，从上部面板放大的装箱区域视图。箭头表示RAB7与LC3B阳性LD的共定位示例（白色）。(B类)ADRB2激动剂刺激RAB7与溶酶体靶向LD的共定位。表达GFP-RAB7和CFP-PLIN1融合蛋白的细胞用异丙肾上腺素处理，固定并免疫染色内源性LAMP1。底部面板，从上部面板放大的装箱区域视图。箭头指示RAB7与LAMP1阳性LD共定位的实例（白色）。N、 核心。用MetaMorph软件计算每组至少10个细胞的共定位百分比，并显示在相应图像右侧的图表中。数据表示平均值±SD，n≥10。
无
图6。在以3T3-L1脂肪细胞溶酶体为靶点的ADRB2刺激LD中需要RAB7。(A类)如图所示，用CFP-PLIN1和突变GFP-RAB7表达载体共同转染细胞，并预先加载LysoTracker Red拉布7突变组在异丙肾上腺素治疗前后显示相同的LD。LD与溶酶体的交联显示为紫色。每组中的右侧面板是对应左侧面板中装箱区域的放大视图。N、 核心。(B类)异丙肾上腺素刺激感染sh细胞前后的实时图像拉布7慢病毒，随后转染CFP-PLIN1并预加载LysoTracker Red。每个敲除组中的箭头显示在异丙肾上腺素治疗前后的LD相同。LD与溶酶体的交联显示为黄色。
无
图7。PLIN1缺乏促进RAB7与LDs的关联，以增强基础脂肪分解。(A类)PLIN1敲除促进LDs与LAMP1染色的内胚体和溶酶体隔室的联系。如图所示，在各种慢病毒介导的敲除组中，在预加载BODIPY 500/510，然后用异丙肾上腺素刺激的固定细胞中对内源性LAMP1进行免疫染色。每组中的右侧面板是对应左侧面板中装箱区域的放大视图。用Hoechst 33342对细胞核进行复染。箭头表示LD与溶酶体共定位的例子（黄色）。使用MetaMorph软件计算每组至少10个选定细胞的共定位百分比，如下图所示。数据表示平均值±SD，n≥10。(B类)RAB7介导PLIN1击倒脂肪细胞中基础甘油释放增加。在脂肪细胞中，在慢病毒介导的PLIN1和/或RAB7的敲低中测量非刺激性甘油释放。数据表示平均值±SD，n=5*与sh相比p<0.01吕克，t检验。
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