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.2013年5月21日；8（5）：e63529。
doi:10.1371/journal.pone.0063529。 2013年印刷。

激活1型大麻素受体（CB1R）促进小鼠脑室下区细胞培养中的神经发生

萨拉·萨佩利 1, 法比安娜·阿加塞, 劳拉·萨达-阿罗约, 莉莉亚娜·贝纳迪诺, 蒂亚戈·桑托斯, 菲利帕·F·里贝罗, 乔治·瓦列夫, 何塞·布拉甘萨, 克拉丽莎·希廷, 里卡多·德梅洛·里斯, 安娜·M·塞巴斯蒂昂, 乔·奥·马尔瓦
附属公司

激活1型大麻素受体（CB1R）促进小鼠脑室下区细胞培养中的神经发生

萨拉·萨佩利等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

内源性大麻素系统与成人神经发生的调节有关。在这里，我们描述了1型大麻素受体（CB1R）激活对小鼠新生脑室下区（SVZ）干/祖细胞培养物中的自我更新、增殖和神经元分化的影响。在SVZ衍生的未成熟细胞（Nestin阳性）、神经元和星形胶质细胞中检测到CB1R的表达。通过计数次级神经球的数量和Sox2+/+细胞对的数量来评估，（R）-（+）-甲基山莨菪碱（R-m-AEA）对CB1R的刺激增加了SVZ细胞的自我更新，这种作用被Notch通路抑制所阻断。此外，R-m-AEA治疗48小时后，通过BrdU掺入试验评估增殖增加，该效应由MAPK-ERK和AKT通路激活介导。令人惊讶的是，在第7天，R-m-AEA刺激CB1R也促进了神经元分化（不影响胶质细胞分化），这是通过计算培养物中NeuN-阳性神经元的数量显示的。此外，通过监测KCl和组胺刺激后单个细胞内的细胞内钙浓度（[Ca（2+）]i），我们观察到神经样细胞增加。当SVZ细胞与R-m-AEA和CB1R拮抗剂AM 251共同孵育7天时，这种前神经原作用被阻断，因此表明这种作用涉及CB1R激活。根据对神经元分化和成熟的影响，R-m-AEA也增加了轴突生长，这是通过量化和测量MAP2阳性过程的数量来评估的。综上所述，这些结果表明，CB1R激活可诱导小鼠新生SVZ细胞的增殖、自我更新和神经元分化。

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竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。SVZ细胞表达CB1R。
答：SVZ中CB1R的Western blotting检测。通道1对应于SVZ增殖细胞，通道2对应于成年C57Bl6小鼠的SVZ提取物，通道3对应于阴性对照（CB1R-KO小鼠的总蛋白）。B–F：描述分化7天后SVZ细胞中CB1R免疫反应的典型共焦数字图像[CB1R（红色）；nestin（绿色），GFAP（绿色）、PSA-NCAM（绿），DCX（绿色）；βIII tubulin（绿）、MAP2（绿色）和Hoechst 33342（用于显示细胞核，蓝色）]。c1、e1和f1分别是C、E和F中正方形的放大倍数。比例尺===========================================================20微米。SVZ：室下区；GFAP：胶质纤维酸性蛋白；PSA-NCAM：聚唾液酸神经细胞粘附；βIII微管蛋白：神经元特异性III类β-微管蛋白；MAP2：微管相关蛋白2；CB1R:CB1受体。
图2
图2。（R） -（+）-甲酰胺促进自我更新。
答：实验方案。B类：条形图表示主要和次要神经球的数量。数据表示为平均值±SEM.N===========================================================6.*P<0.05，**P<0.01和***P（P）<0.001，使用Dunnett的多重比较试验与对照进行比较；###使用Dunnett的多重比较试验，与R-m-AEA进行比较，P<0.001。抄送：用于研究细胞比率的协议。医生：（a）SVZ细胞对称分裂为两个Sox2+细胞（Sox2+/+），（b）不对称分裂为Sox2+和Sox2-祖细胞（Sox2+/-），以及（c）对称终端分裂为两种Sox2-祖先细胞（Sox2-+/-）后获得的细胞对共聚焦数字图像。标尺20µm。电子：条形图显示了计数的每种类型的单元划分数。数据表示为总细胞对的百分比，并表示为平均值±SEM.N===========================================================5.*P<0.05和***P<0.001，使用Bonferroni的多重比较试验，与各自的对照进行比较；###使用Bonferroni的多重比较试验，与相应的R-m-AEA进行比较，P<0.001。SOX2：性别决定区Y框2。
图3
图3。（R） -（+）-甲酰胺在SVZ细胞培养中诱导细胞增殖。
答：用于研究细胞增殖的协议。B类：条形图描绘了BrdU阳性细胞的数量，以细胞总数的百分比表示。数据表示为平均值±SEM.N===========================================================3–5. **P（P）<0.01，使用Dunnett的多重比较试验与对照进行比较。抄送：SVZ培养物中BrdU（红核）阳性细胞和Hoechst 33342染色（蓝核）的代表性数字图像。医生：通过密度测定法评估BrdU掺入量（450 nm）。N个===========================================================10.*P<0.05，**P<0.01和***P（P）<0.001，使用Dunnnet多重比较试验与对照进行比较；##P<0.01和###与R-m-AEA进行比较时，使用Dunnnet多重比较试验，P<0.001；比例尺===========================================================50微米。
图4
图4。（R） -（+）-甲酰胺不会通过CB1R激活在SVZ培养物中诱导胶质细胞分化。
答：用于研究胶质细胞分化的方案。B类：SVZ中GFAP和Olig2蛋白水平的Western blot分析。数据表示为平均值±SEM.N===========================================================4抄送：条形图描述了GFAP和Olig2-阳性细胞的数量，用总细胞的百分比表示每文化。数据表示为平均值±SEM.N===========================================================三。医生：GFAP阳性细胞（绿色）、Olig2阳性细胞（红色）和Hoechst染色（蓝色细胞核）的代表性荧光数字图像。比例尺===========================================================50微米。
图5
图5。（R） -（+）-甲酰胺通过CB1R激活诱导SVZ培养中的神经元分化。
答：协议的示意图。B类：条形图描述了神经样反应细胞的数量，以SCCI分析的总细胞百分比表示。N个===========================================================4-8.*P<0.05，***P<0.01，使用Dunnett的多重比较试验与对照进行比较。抄送：对照、R-m-AEA和R-m-AEA+AM 251处理的培养物中约20个细胞的代表性SCCI响应谱。D类：NeuN阳性神经元（红色）和Hoechst染色（蓝色细胞核）的代表性荧光数字图像。比例尺===========================================================50微米。电子邮箱：条形图描述了NeuN-阳性细胞的数量，表示为总细胞的百分比每文化。数据表示为平均值±SEM.N===========================================================5***P<0.001，使用Dunnett的多重比较试验与对照进行比较。SCCI：单细胞钙显像；NeuN：神经核。
图6
图6。（R） -（+）-甲酰胺促进成神经细胞增殖。
A、 医生：实验方案。B、 电子邮箱：BrdU（红色）、βIII微管蛋白（绿色。比例尺===========================================================20微米。C、 传真：条形图显示了βIII微管蛋白/BrdU阳性细胞的数量，表示为总βIII微管蛋白阳性细胞（C）的百分比，以及NeuN/BrdU阳性细胞，表示为每个培养物中总NeuN-阳性细胞（F）的百分比。数据表示为平均值±SEM.N===========================================================3.*P＜0.05，**P＜0.01，使用未配对的Student t检验与对照组进行比较。βIII微管蛋白：神经元特异性III类β-微管蛋白；NeuN：神经核。
图7
图7。（R） -（+）-甲酰胺促进前神经原基因的表达Ngn1型.
答：协议的方案。B类：条形图描述了H3K36m3在启动子区的募集倍数增加Ngn1型通过qChIP分析量化基因。C类：条形图描述了通过qRT-PCR分析评估的Ngn1蛋白mRNA表达的倍数增加。数据表示为平均值±SEM.N===========================================================4-7.*P<0.05，使用Dunnett检验与对照组进行比较（设置为1）。H3K36m3：组蛋白H3在赖氨酸36上三甲基化；Ngn1：神经生成素1；qChIP：染色质定量免疫沉淀；qRT-PCR：定量实时聚合酶链反应。
图8
图8。（R） -（+）-甲酰胺诱导GABA能神经元分化和神经发生。
答：协议的示意图。B类：条形图描述了VGAT-或TH/βIII微管阳性细胞的数量，以总细胞的百分比表示。数据表示为百分比±SEM.N===========================================================3. *P（P）<0.05，使用未配对的Student t检验与对照组进行比较。抄送：神经发生研究所用方案的示意图。医生：对照培养物和R-m-AEA暴露培养物中GFP（绿色）、MAP2（红色）、Hoechst染色（蓝色）的典型共焦数字图像。比例尺===========================================================20微米。电子邮箱：条形图描述（从左到右）：每个细胞的MAP2轴突总长度（µm）、初级分支数量和次级分支数量。N个===========================================================3.**P<0.01使用未配对学生的t检验与对照进行比较。MAP2：微管相关蛋白2；TH：酪氨酸羟化酶；βIII微管蛋白：神经元特异性III类β-微管蛋白；VGAT：囊泡GABA转运体。
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赠款和资金

该工作由葡萄牙技术基金会资助(网址：www.fct.mctes.pt)，项目POCTI/SAU-NEU/68465/2006；PTDC/SAU-NEU/104415/2008；PTDC/SAU-NEU/101783/2008、POCTI/SAU-NEU/110838/2009和Fundaço Calouste Gulbenkian（项目编号96542）。Sara Xapelli、Liliana Bernardino、Filipa F.Ribeiro和Jorge Valero获得了Fundaçáo para a Ciñncia e Tecnologia的奖学金。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。