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.2013年5月21日；8（5）：e63528。
doi:10.1371/journal.pone.0063528。 2013年印刷。

老肌肉干细胞的再生能力下降，而DNA损伤没有显著累积

温蒂表姐 1, 米歇尔·丽安·何, 拉吉夫·德赛, 安德烈亚·塔姆, 罗伯特·尤岑（Robert Yuzen Chen）, Sunny Kung先生, 克里斯蒂安·埃拉布, Irina M Conboy公司
附属机构

老肌肉干细胞的再生能力下降，而DNA损伤没有显著累积

温迪表妹等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

成体干细胞的性能对组织内稳态至关重要，但随着年龄的增长，其再生能力下降，导致多器官衰竭。在骨骼肌中，这种失败表现为功能组织的丧失、纤维化的积累以及损伤后卫星细胞介导的肌生成减少。虽然最近的研究表明，卫星细胞生态位组成的变化至少在一定程度上是衰老导致功能受损的原因，但人们对衰老对卫星细胞固有特性的影响知之甚少。例如，它们修复DNA损伤的能力以及DNA双链断裂（DSBs）的潜在积累对其再生性能的影响尚不清楚。这项工作表明，与年轻人相比，在细胞分离后和组织切片中，无论是在未受伤的肌肉中还是在受伤后的多个时间点，老肌肉干细胞都没有显示出明显的DNA DSB积累。此外，DNA DSB修复蛋白或全球检测的DNA损伤反应基因的表达没有显著差异，这表明不仅DNA DSB，而且其他类型的DNA损伤，都没有显著标记老化的肌肉干细胞。来自DNA DSB修复缺陷SCID小鼠的卫星细胞的天然DNA DSB水平确实高得出乎意料，并且从γ辐射诱导的DNA损伤中恢复能力减弱。有趣的是，它们在体外和体内都与年轻野生型小鼠的卫星细胞一样具有肌源性，这表明DNA DSB修复效率低下与损伤后肌肉再生能力没有直接关系。总之，我们的研究结果表明，DNA DSB修复缺陷不太可能是老化后肌肉再生下降的关键因素。

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竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。随着年龄的增长，肌肉干细胞中的DNA DSB没有差异。
（A-F）从年轻和老年C57BL/6小鼠和年轻SCID小鼠的后腿肌肉中分离出未损伤肌肉或损伤不同时间激活的卫星细胞，进行γ-H2AX（绿色）（A-D）或53BP1（绿色）的免疫染色，并用DAPI（蓝色）进行复染。（A） γ-H2AX病灶/核的装箱范围的代表性图片。比例尺表示5µm。（B-C）肌肉损伤后72小时活化卫星细胞中γ-H2AX病灶的定量。每只小鼠至少计数140个细胞。数据表示平均值+/-SEM，n = 每组4只小鼠；双尾非配对学生t检验，*：p值<0.05。（B） 病灶/细胞核的边界范围。（C） γ-H2AX阳性细胞百分比( = 5个病灶/细胞核）。（D） 损伤后12、24和36小时，未损伤肌肉（uninj）和损伤肌肉卫星细胞中γ-H2AX阳性核的定量。年轻和年老的老鼠分别用黑点和红色方块表示。每个点或方块代表一种动物，线条对应于平均值。每个时间点使用2只年轻和2只老年小鼠，每只小鼠至少计数100个细胞，双尾非配对Student t检验，*：p值<0.05，**：p值<0.01（黑色*年轻未成年人vs 12、24或36小时，红色*老年未成年人vs.12、24和36小时）。（E） 53BP1阳性细胞的代表性图片。比例尺表示5µm。（F） 53BP1阳性细胞数( = 5个病灶/细胞核）在未损伤肌肉和损伤后36小时的年轻和老年小鼠之间进行比较。每只小鼠至少计数100个细胞。数据表示为平均+/-SEM，n = 每种情况2只小鼠，双尾非配对Student t检验，*：p值<0.05（未受伤与受伤），未观察到年龄差异。（G-H）冷冻切片年轻、老年野生型小鼠和年轻SCID小鼠的胫骨前肌。10 ?m冰冻切片进行γ-H2AX免疫染色和DAPI复染。使用最大像素强度将共焦Z系列图像投影到单个平面中。（G） 放大代表性图片，显示γ-H2AX阳性卫星细胞（白色箭头）。DAPI以蓝色表示，γ-H2AX以红色表示。比例尺表示10µm。（H） ？的百分比-比较年轻、老年和SCID小鼠相对于年轻小鼠卫星位置的H2AX阳性细胞。在Z轴投影图像上，每只老鼠至少有150个细胞核被打分。数据表示平均值+/-SEM，n = 每组3只小鼠；双尾非配对学生t检验，*：p值<0.05。
图2
图2。随年龄增长卫星细胞放射敏感性和DNA修复途径的评估。
（A–B）用western blotting检测同源重组和非同源末端连接的主要蛋白的表达。肌肉损伤后72小时，从活化的卫星细胞中制备蛋白核提取物。拉明B被用作内部负荷控制。（A） 西方斑点的代表性图像。（B） 使用Image J软件进行量化。数据表示平均值+/-SEM，n = 3至5（n = 来自3只小鼠的肌肉池），双尾未配对Student t检验，无显著差异。（C） 数据的图形表示表S1老年人相对于年轻人的卫星细胞的基因表达表现为12个相对表达具有统计学意义的基因的95%置信区间的折叠变化，n = 每组3只小鼠，双尾非配对学生t检验，*：第页值<0.05。虚线表示年轻级别。BER：基底切除修复，NER：核苷酸切除修复；MR：错配修复，DRR：DNA修复相关。（D–E）卫星细胞是从C57BL/6年轻和老年小鼠以及年轻SCID小鼠的未受伤（D）或受伤（E）肌肉72小时后新鲜分离的。细胞以低密度电镀，以指示的格雷（Gy）剂量照射，并培养10天。对辐照细胞形成的肌细胞集落进行量化，并相对于其各自的未辐照对照进行表示。平均而言，未受辐射的年轻、老年和SCID损伤小鼠的肌原性菌落数分别为178、77和228个，未受辐照的年轻、老龄和SCID受损小鼠的肌源性菌落总数分别为67、34和91个。数据表示平均值+/-SEM，n = 每组3-4只小鼠，双尾非配对Student t检验，a、b或c：第页值<0.05，（a：年轻与老年，b：年轻与SCID，c：老年与SCID）。
图3
图3。DNA DSB修复缺陷SCID小鼠的肌肉再生和肌源性集落形成没有下降。
（A） 对年轻、年老野生型小鼠和年轻SCID小鼠的胫骨前肌进行损伤，5天后评估再生成功率。使用苏木精和伊红（H&E）在冰冻切片上进行组织学检查，用eMHC免疫荧光（红色）检测新形成的纤维，并用DAPI（蓝色）进行复染。比例尺表示50µm。（B） 使用H&E染色定量每平方毫米新形成的纤维。数据表示平均值+/-SEM，n = 每组3-4只小鼠，双尾非配对Student t检验，*：第页值<0.05；**：第页值<0.01。（C） 从年轻和老年野生型小鼠和年轻SCID小鼠的未损伤（unj.）或损伤后72小时的肌肉中分离卫星细胞（SC），并在低密度下进行电镀。相对于未受伤的年轻人，对肌源性菌落进行量化和表示。平均而言，年轻、老年和SCID未受伤的每只小鼠分别获得178、77和228个肌源性集落评分，年轻、老年和SCID受伤的每只小鼠分别获得67、34和91个肌源性集落评分。数据表示平均值+/-SEM，n = 每组3-4只小鼠，双尾非配对Student t检验，**：第页值<0.01；***：第页值<0.001。
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