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.2013年10月：58:57-67。
doi:10.1016/j.nbd.2013.05.007。 Epub 2013年5月20日。

线粒体疾病相关蛋白Ndufaf2对复合物-1的组装是不必要的，但对氧化应激的调节至关重要

朱莉娅·施莱赫 1, Marion S M Journel公司, 凯尔西·P·泰勒, 凯瑟琳·D·阿莫迪奥, 马修·杰·拉沃伊
附属公司

线粒体疾病相关蛋白Ndufaf2对复合物-1的组装是不必要的，但对氧化应激的调节至关重要

朱莉娅·施莱赫等。 神经生物学疾病. 2013年10月.

摘要

人类线粒体复合物-1缺乏与多种神经系统疾病有关。复合物1相关蛋白Ndufaf2的纯合缺失导致严重的青少年脑病，包括黑质和其他皮层下区域的退化，导致青少年死亡。为了了解Ndufaf2在复合物-1功能中的确切作用及其与神经疾病的联系，我们研究了在Ndufaf2缺乏的多个体外模型中对复合物-1组装和功能的影响，以及细胞水平的病理后果。使用Ndufaf2缺陷的人神经母细胞瘤细胞和从Ndufaf2基因敲除小鼠培养的原代成纤维细胞，我们发现Ndufaf2-缺陷选择性地降低复合物-1的活性。虽然Ndufaf2传统上被称为复合物-1的组装因子，但令人惊讶的是，Ndufaf2-缺陷细胞能够组装完全成熟的复合物-1酶，尽管动力学降低。重要的是，没有观察到中间或不完全组装的证据。Ndufaf2缺乏导致氧化应激和线粒体DNA缺失显著增加，这与当代关于复杂-1疾病遗传突变的病理生理学假设一致。这些数据表明，与其他复合物-1组装因子不同，Ndufaf2可能被更准确地描述为在复合物-1装配期间参与正确折叠的伴侣，因为它对复合物-1成熟是不必要的，但不是其正确功能。

关键词：复合物-1组装；复合物-1疾病；让开；线粒体；线粒体DNA突变；光学字符识别；氧化应激；PBS；聚偏氟乙烯；活性氧；重量；淘汰赛；线粒体DNA；线粒体DNA；不显著；纳秒；耗氧率；磷酸盐缓冲液；聚偏氟乙烯；活性氧；野生型。

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数字

图1
图1
Ndufaf2下调导致人类神经母细胞瘤细胞线粒体损伤。a） 左图：用Ndufaf2 shRNA-407稳定转导SK-N-MC细胞可降低SDS-PAGE和Western blot测定的Ndufaf2蛋白水平。肌动蛋白被用作加载控制。右：用Ndufaf2 shRNA稳定转导后，Ndufaf2mRNA总水平降低。在ΔΔCT方法中，肌动蛋白、18SrRNA和TBP被用作看家基因（n=3，平均值+SEM，Student’s T-Test，*，p<0.0001）。b） 用1%DDM提取线粒体制剂，0.5%或1%Triton-X100复合物-1用BN-PAGE和Western blot进行分析，并探测复合物-1亚基Ndufa9（C1:复合物-1），剥离并复制SDHA（C2:复合物-2）c）分析蛋白质标准化的粗线粒体制剂的复合物-1和复合物-2的酶活性（n=5，Student’s T检验，**，p<0.005）。相应制剂的柠檬酸合成酶活性相等（未显示）。d） 用1%洋地黄提取线粒体制剂。通过BN-PAGE和Western blot分析复合物-1和复合物-3，并探测复合物-1亚基Ndufa9（C1/3：超复合物-1/3）和复合物3亚基Rieske-FeS（C3：复合物-3）。e） 细胞保存在1μg/ml多西环素中5天，换回正常生长培养基，并在更换培养基后的指定时间收集。线粒体组分的DDM提取物在BN-PAGE上分析了复合物-1亚单位Ndufa9、复合物-3亚单位Rieske-FeS和复合物-2亚单位SDHA（Ctrl.=对照shRNA，Ndu.=Ndufaf2 shRNA）。f） 用1%Triton-X提取对照和Ndufaf2 shRNA细胞的线粒体制剂，并使用针对复合物-2亚单位SDHA（C2）、复合物-3亚单位Riesk-FeS（C3）、复合物质-4亚单位CO1（C4）和复合物-5亚单位ATP5A（C5）的抗体，通过BN-PAGE和Western blot进行分析。复合体用箭头表示。
图2
图2
Ndufaf2 KO成纤维细胞中正常复合物-1的成熟。a） 小鼠皮肤成纤维细胞中Ndufaf2 KO的SDS-PAGE和Western blot分析。肌动蛋白被用作加载控制。b） 分析WT和Ndufaf2-KO皮肤成纤维细胞的蛋白质标准化粗线粒体制剂的复合物-1的酶活性。c） 用0.5%的DDM提取WT、Ndufaf2 KO和NdufS4 KO成纤维细胞的线粒体制剂。通过检测复合物1亚基Ndufa9，利用BN-PAGE和Western blot分析复合物1的成熟度。d） 用0.5%DDM提取WT、Ndufaf2 KO和NdufS4 KO成纤维细胞的线粒体制剂，并通过BN-PAGE和Western blot检测Ndufaf2。
图3
图3
Ndufaf2击倒细胞中的延迟细胞生长。a） 对照和两个Ndufaf2 shRNA稳定细胞系的代表性生长曲线。b） 将SK-N-MC对照细胞和Ndufaf2 shRNA细胞接种于5×105使用台盼蓝排除法根据活细胞数计算每个孔的细胞数、在不同时间点收集的细胞数和加倍时间。所示为对照组和Ndufaf2 shRNAs-407（1）和-169（2）的不同敲除效率（n=4，平均值+SEM，单向方差分析/Dunnett’s，*，p<0.001，#，p<0.01）。c）在线性生长期间，对照组和Nedufaf2细胞在70%的汇合处固定并渗透，并用碘化丙啶染色以标记DNA。用流式细胞仪记录细胞周期相，并用flow-Jo分析（n=6，平均值+SEM，单向方差分析/Tukey的多重比较试验，无显著性（ns））。d） 通过光度法测定对照组和Ndufaf2 shRNA SK-N-MC细胞总细胞裂解液中的ATP水平（N=7，平均值+SEM，学生T检验，ns）。e） 为了分析总细胞死亡率，通过台盼蓝排除法测定活细胞和死细胞数，并以活细胞和死亡细胞占总计数细胞的百分比表示（n=3，平均值+SEM，学生T检验，ns）。f） 通过Caspase-3染色和流式细胞术（N=3，平均值+SEM，Student’s T-Test，ns）对对照组和Ndufaf2 shRNA SK-N-MC细胞的凋亡率进行量化。
图4
图4
Ndufaf2击倒后生物能量学和膜电位发生变化。a） 和b）在糖酵解（a）和氧化（b）条件下，通过从基线OCR中减去鱼藤酮抑制OCR来测定基础呼吸。在糖酵解（c）和氧化（d）条件下，通过从基线OCR中减去寡粘菌素抑制的OCR来确定ATP周转率（n=4，平均值+SEM，学生T检验。*p<0.005，ns）。使用TMRM分析活细胞中的线粒体膜电位，并在糖酵解（e）和氧化（f）条件下通过流式细胞仪进行量化（n=3，平均值+SEM，单向方差分析，ns）。
图5
图5
Ndufaf2敲除增加线粒体超氧化物。a） 线粒体超氧化物用MitoSOX标记，荧光用流式细胞术定量（n=7）。对于救援实验，用100μM维生素E预处理细胞18小时（n=3）。所示为荧光强度中值（平均值+扫描电镜，1向方差分析/Tukey多重比较试验。*，p<0.001，#，p<0.01）。b） 对照组和Ndufaf2 shRNA SK-N-MC细胞生长在涂有纤维连接蛋白的玻璃底皿上，与Mitotracker（绿色）、MitoSOX（红色）和CellMask（蓝色）平行染色，并在共焦显微镜上实时成像。显示了三个独立实验的代表性图像。c） 糖酵解（左侧面板）和氧化（右侧面板）条件下MnSOD的SDS-PAGE和Western-blot分析。肌动蛋白被用作加载控制。使用密度测定法进行定量（n=6，平均值+扫描电镜，未配对学生的T检验。*，p<0.005，#，p<0.05）
图6
图6
Ndufaf2下调后氧化损伤增加。a） 使用针对固定细胞的8-氧胍的FITC标记的抗体检测氧化损伤。通过流式细胞术对中位荧光进行定量（n=4，平均值+SEM，学生T检验，*，p<0.05）。b） 使用Bodypy 581/591探针测定脂质过氧化物水平（n=4）。对于救援实验，用100μM维生素E预处理细胞24小时（n=3，平均值+扫描电镜，1向方差分析/Tukey多重比较试验，*，p<0.001，#，p<0.01）。c） Ndufaf2-ko小鼠皮肤成纤维细胞分析如a）所示。此外，在非糖酵解条件下培养细胞（5 mM半乳糖、50μg/ml丙酮酸、1 mM丙酮酸；n=3，平均值+扫描电镜，1向方差分析/霍尔姆·西达克多重比较试验，*<0.005）。d） Ndufaf2击倒后线粒体DNA缺失增加。从对照细胞和Ndufaf2 shRNA SK-N-MC细胞中分离出总DNA，并对线粒体ND1和ND4基因进行实时PCR。所示为相对于对照组的ND1/ND4比率（n=3，平均值+SEM，学生T检验，*，p<0.01）。
图7
图7
Ndufaf2下调的病理后果示意图。使用shRNA和KO方法，我们观察到几个水平的氧化应激增加指数，以及线粒体DNA损伤。
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