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.2013年8月30日;394(1-2):55-61.
doi:10.1016/j.jim.2013.05.003。 Epub 2013年5月13日。

AXM诱变:一种高效的蛋白质定向进化文库生成方法

附属公司

AXM诱变:一种高效的蛋白质定向进化文库生成方法

埃里卡·G·荷兰等。 免疫方法杂志. .

摘要

亲和力成熟是重组抗体开发过程的重要组成部分。有几种成熟的方法可以生成用于亲和力成熟的突变抗体基因库,但这些方法通常过于费力或昂贵,无法实现多个抗体的高通量并行处理。在这里,我们描述了一种可扩展的方法,该方法能够从单个大肠杆菌转化中生成10(8)个以上克隆的文库。在我们的方法中,使用PCR条件产生一个突变的DNA片段,该条件促进核苷酸错误整合到新合成的DNA中。在PCR反应中,其中一个引物在其5'端包含至少三个硫代磷酸键,用5'至3'外切核酸酶处理PCR产物,以优先去除用非修饰引物合成的链,从而产生单链DNA片段。然后,该片段作为一个大引物,在一个Kunkel样诱变反应中,在尿嘧啶化的圆形单链模板上启动DNA合成,该反应偏向于大引物和尿嘧啶化DNA序列之间的核苷酸碱基变化,从而有利于体外合成的大引物。这种方法消除了从随机突变抗体基因构建亲和力成熟库通常需要的低效亚克隆步骤。

关键词:亲和力成熟;定向进化;噬菌体显示;重组抗体。

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