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.2013年7月5日；288（27）：20014-33。
doi:10.1074/jbc。M112.438895。 Epub 2013年5月9日。

来自HIV-1感染细胞的外显子含有反激活反应元件RNA

阿提·纳拉亚南 1, 谢尔盖·奥尔丹斯基, 拉维·达斯, 雷切尔·范·杜因, 史蒂文·桑托斯, 伊丽莎白·贾沃斯基, 艾琳·根德尔, 加文·桑佩, 伊丽莎白·达尔比, 玛丽亚·伊格莱西亚斯·乌塞尔, 阿纳斯塔斯·波普拉蒂洛夫, 拉明·哈卡米, Kylene Kehn-Hall公司, 玛丽·杨, 卡罗琳·苏布拉, 卡罗琳·吉尔伯特, 查尔斯·贝利, 法比奥·罗梅里奥, 法塔赫·卡珊奇
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来自HIV-1感染细胞的外显子含有反激活反应元件RNA

阿提·纳拉亚南等。 生物化学杂志. .

摘要

外显体是健康和病毒感染细胞产生的纳米大小的囊泡。来自感染细胞的外显子被证明含有病毒microRNA（miRNAs）。HIV-1编码自己的miRNAs，调节病毒和宿主基因的表达。最丰富的HIV-1衍生miRNA是反激活反应元件（TAR）miRNA，最初由我们报道，后来由其他人使用深度测序法报道。在本研究中，我们证明了TAR RNA存在于HIV-1感染细胞的细胞培养上清和患者血清的外泌体中。TAR miRNA不在外泌体外的Ago2复合物中，而是被外泌体内包裹。我们在感染细胞的外泌体中检测到宿主miRNA机械蛋白Dicer和Drosha。我们报道，TAR RNA从细胞核运输到外泌体是一个依赖于CRM1（染色体区域维持1）的活性过程。先前将原始细胞暴露于感染细胞的外泌体会增加受体细胞对HIV-1感染的敏感性。外体TAR RNA通过降低受体细胞中的Bim和Cdk9蛋白下调凋亡。我们在感染培养上清的外泌体中发现10（4）-10（6）拷贝/ml TAR RNA，在高活性抗逆转录病毒治疗患者或长期非进展患者的血清外泌体内发现10（3）拷贝/ml TAR RNA。总之，我们的实验表明，HIV-1感染细胞产生的外泌体具有独特的特征，其蛋白质组和RNA图谱可能有助于艾滋病的疾病病理学。

关键词：艾滋病；细胞凋亡；细胞周期；外显子；Gag公司；HIV-1；传染性；Nef；焦油。

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数字

图1。
图1。
TAR RNA存在于感染的细胞培养上清液和HIV-1感染患者的血清中。 A、，从感染HIV-1 NL4-3 72 h的8E5、ACH-2、U1、HLM-1、J1.1细胞和PHA和IL-2活化的外周血淋巴细胞培养上清中分离出的总RNA，用RT-SYBR Green实时PCR和HIV-1 TAR、U3-R LTR和Env序列特异性引物进行定量。相对RNA计数显示为在每个细胞培养上清液样本中检测到的TAR HIV-1 RNA峰值计数的百分比。误差线显示三种独立制剂的标准偏差±S.D。单个星号表示第页≤ 0.05;双星号表示第页≤0.01。B、，使用TAR RNA和病毒mRNA特异性引物，通过qRT-PCR分析从U1和HLM-1细胞培养上清液中分离的总RNA，包括vpu、vpr、vif、nef、tat、env、rev、，和中描述的未切割HIV-1 RNAA类结果显示为三个独立测量值±S.D.的平均值。双星号表示第页≤ 0.01.C中，从未感染对照组、HAART治疗组和LTNP患者组的1 ml混合血清（6名个体患者）中分离出的总RNA通过qRT-PCR和TAR-RNA特异性引物进行分析，如A.误差线显示两个独立测量的标准误差。
图2。
图2。
从HIV-1感染细胞中分离出的外显子具有典型特征。 A、，从5天龄的细胞培养上清液和相应的WCE中获得的Jurkat和J1.1衍生外泌体在三甘氨酸凝胶中溶解并经银染色。从Jurkat和J1.1-exosome通道中切除迁移接近65kDa的带，并由MALDI-TOF MS进行分析。B、，使用CD63、CD45、Hsp70、Alix、细胞色素抗体，通过Western blots分析Jurkat和J1.1衍生的外泌体及相应的WCEc（c）和β-肌动蛋白。C中，通过透射电镜观察到了Jurkat和J1.1衍生的外泌体，并指出了多个具有代表性的外泌物体。
图3。
图3。
来自HIV-1感染细胞的外显子含有TAR RNA。 A、，从J1.1衍生的外泌体中分离出总RNA，并使用TAR RNA、U3-R LTR序列和未切割HIV-1 RNA的特异性引物进行qRT-PCR分析，如A.误差条显示三种独立RNA制剂的标准偏差；双星号表示第页≤ 0.01.B、，来自健康供体的原代细胞（PBMC）被抗CD3/CD28激活，然后感染HIV-1IIIB类（ABI）。在接种后3、6和9天收获培养上清液；分离外体部分，然后纯化总RNA，并用TAR和未片段HIV-1 RNA特异性引物进行定量RT-PCR分析。结果显示为三个独立测量值±S的平均值。D。；这个星号表示第页≤ 0.05.C中，原代细胞被激活，如B类当10–15%的细胞被感染时，将培养物收集、清洗，并在补充有1 ng/ml IL-7（R&D系统）的完整培养基（无外泌体）中培养7天，以使细胞恢复静止。未受感染的细胞与对照细胞一同保存。从未感染和感染细胞培养上清液中富集的外显子中获得总RNA，并用TAR和env RNA引物进行qRT-PCR分析。误差线显示三种独立制剂的标准偏差。双星号表示第页≤ 0.01.D、，从Jurkat和J1.1衍生的外泌体中分离出总RNA，并使用miR16、5′和3′TAR miRNA特异性引物通过RT-PCR（QuantiMiR small RNA analysis method）进行分析。RT-PCR后，扩增产物在4–20%三甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上进行解析，并用溴化乙锭染色后进行可视化。E中，用抗Ago2抗体免疫沉淀Jurkat和J1.1衍生的外泌体。使用IgG抗体进行免疫沉淀作为对照。提取与抗体相关的所有RNA，并使用QuantiMiR小RNA分离和分析协议进行cDNA合成。一半的分离RNA用于cDNA扩增过程，30%的扩增cDNA用于对miR16、5′TAR miRNA和3′TAR micRNA进行5′引物的RT-PCR。扩增的DNA产物在聚丙烯酰胺凝胶中溶解，用溴化乙锭染色，并使用分子成像仪ChemiDoc XRS系统（Bio-Rad）进行可视化。外显子，外泌体；啜饮，培养上清液。
图4。
图4。
J1.1衍生的外泌体含有病毒成分。 A、，TZM-bl细胞在Jurkat或J1.1衍生外泌体浓度增加的情况下培养24小时，并通过荧光素酶分析报告基因活性。转染Tat-expressing结构的TZM-bl细胞作为荧光素酶活性的阳性对照。这个误差线显示三个独立测量的标准偏差。B、，将未感染的CEM细胞与J1.1衍生的外泌体孵育24、48和72小时。裂解整个细胞颗粒以获得总RNA。然后使用TAR RNA特异性引物通过qRT-PCR分析RNA。未经处理的CEM细胞作为阴性对照。结果显示为三种独立RNA制剂±S.D.的平均值。C中，将未感染的CEM细胞与J1.1衍生的外泌体孵育72 h，然后分离总RNA，并将其用于QuantiMiR分析，以使用miR16、5′和3′TAR miRNA引物分析小RNA物种。将未与外泌物孵育CEM细胞获得的总RNA作为阴性对照，尽管J1.1细胞的RNA被用作5′和3′TAR miRNA的阳性对照。PCR产物在聚丙烯酰胺凝胶上分解，用溴化乙锭染色，并可视化。D、，J1.1外泌体用尿素裂解，胰蛋白酶解过夜，并通过LC-MS/MS分析以鉴定病毒成分。指出了正确的肽鉴定概率、Xc评分、分子量和鉴定蛋白质的加入数。
图5。
图5。
J1.1衍生的外显子包含RNAi机制的成分。 A、，在4–20%三甘氨酸凝胶上分离Jurkat和J1.1衍生的全细胞提取物和外泌体，并使用Dicer、Drosha、exportin、Ago2、DGCR8、TRBP和β-actin抗体通过Western blot进行分析。从J1.1衍生的外泌体中分离的总RNA，用和不用钩端霉素B处理（10n米)用TAR-reverse引物进行qRT-PCR(B类)和寡核苷酸（dT）引物(C类). 然后用SYBR-Green实时PCR对cDNA进行定量，并使用HIV-1 TAR和env序列的特异引物集。误差线显示三种独立RNA制剂的标准偏差。双星号表示第页≤ 0.01.
图6。
图6。
受感染原代细胞的外显子含有TAR RNA。 A、，OptiPrep速度梯度离心培养上清液后外泌体和病毒的洗脱曲线示意图。MP公司，分子量颗粒。B、，测定组分的乙酰胆碱酯酶活性，以确定含有纯外泌体的组分数量。这个x个axis显示了在适当的梯度中碘克山诺的百分比年轴显示相对AchE函数。误差线显示两种独立制剂的标准误差。C中，用TAR和env特异性引物对从感染的原代细胞培养上清液中分离的总RNA进行qRT-PCR。D、，用p24抗体对从组分中获得的总蛋白进行Western blot分析并量化。C类和D、，数据表示为三个独立测量值±S.D.的平均值。单个星号表示第页≤ 0.05;双星号表示第页≤ 0.01.序号，上清液。
图7。
图7。
J1.1衍生的外泌体通过下调Bim对细胞死亡提供保护。 A、，用Jurkat衍生外体或J1.1衍生外体处理Jurkat细胞2 h。以增加的浓度（1、3和5μl）将Fas抗体添加到细胞中，然后再维持细胞48 h，然后通过流式细胞仪分析细胞周期分布。未经处理的Jurkat对照组与对照组同时进行。这个面板基于用碘化丙啶染色的颗粒的大小指示记录的事件的分布。这个外部红色框在每个面板中指示记录的事件的百分比，并且内部红色框表示从IgM聚集和死亡细胞（亚G前体）中显示细胞聚集的细胞百分比（在总事件中）1人口）。细胞周期不同阶段中确定的细胞总百分比在表格格式如下所示。B、，在pol III启动子的控制下，用表达野生型TAR或扰乱型TAR序列的构建物转染293T细胞。转染48小时后，获得全细胞提取物，并通过Western blot分析Bim、Cdk9、Cdk2和β-actin。C中，用Jurkat或J1.1衍生外体处理293T细胞48小时。用Western blot分析整个细胞裂解液中总Bim、Cdk9、Cdk2和β-actin的相对水平。D、，在存在野生型或打乱的TAR RNA的情况下，测定Bim和Cdk9启动子上转录调节剂（如HDAC1和SUV39H1）的招募。使用转染细胞和RNA pol II、HDAC1、Ago2和SUV39 H1抗体进行ChIP分析。使用Bim和Cdk9引物扩增沉淀的DNA，在2%琼脂糖凝胶上溶解，并用溴化乙锭染色。E中，用从抗戈米特处理的J1.1细胞（表示为赖)或从Nef获得的外泌体+或Nef−病毒（分别为NL4.3_92BR020.4nef+_IRES_EGFP和NL4.3~92BR020.4 nef_IRES_EGFP，表示为pNL4）被指定。误差线显示两个独立测量的标准误差。
图8。
图8。
先前接触J1.1衍生的外泌体使原始受体细胞更容易感染HIV-1。 A、，CEM、U937和THP1细胞首先与Jurkat或J1.1衍生外泌体孵育24小时，然后感染HIV-1（89.6病毒株（0.5 ng/p24/μl；100μl））。未经处理、未感染的模拟细胞保持为阴性对照，未经治疗、病毒感染的细胞保持为阳性对照。病毒感染后5天从所有细胞上取上清液进行RT分析。数据是从每个样品的三个独立副本中获得的，代表了两个完全独立的实验。误差线显示±S.D。B、，J1.1细胞首先转染200 n米在230 V下使用电穿孔法对5′和3′TAR miRNA的拮抗剂。之前已经描述过5′和3'TAR miRNA（siTAR1和siTAR2（46））。未转染的J1.1细胞作为对照。从未转染和转染的J1.1细胞中分离出外显子，并用于与未转染的U937细胞孵育，随后细胞感染HIV-1（89.6病毒（0.25 ng/p24/μl；10μl））。使用病毒感染后5天从所有细胞获得的上清液测定RT水平。数据代表每个样本的三个副本；误差线显示标准偏差。
图9。
图9。
来自转染（pNL4-3）或感染（89.6）Jurkat细胞培养上清液的外显子含有TAR RNA。 A、，早期对数生长Jurkat细胞（2.5×107)使用电穿孔用20μg pNL4-3转染或用89.6 HIV-1株（~200 ng p24阳性病毒）感染，并在无外泌体培养基中维持5天。进一步处理这些转染和感染细胞的上清液（每个50 ml），以检测是否存在外泌体。pUC19（20μg）作为电穿孔的阴性对照。使用WCE或使用CD45、Hsp70、p24和细胞色素抗体与外显子进行蛋白质印迹c.乙，通过qRT-PCR分析转染和感染Jurkats的外显子是否存在TAR RNA。误差线显示三个独立测量的标准偏差。从感染的Jurkat细胞培养上清液中分离的外泌体(C类)和转染Jurkat培养上清液(D类)利用U937细胞进行感染性实验。简单地说，将U937细胞与每组外显子培养24小时，然后感染89.6株HIV-1（0.5 ng/p24/μl；100μl）。感染后5天对上清液进行RT活性分析。数据来自每个样本的三个独立重复。误差线显示±S.D。
图10。
图10。
血清外泌体中可检测到TAR RNA、Dicer和Drosha。 A、，从未感染（对照）、HAART治疗和LTNP HIV-1感染患者组的混合血清中分离出外显体，并用TAR-和env-特异性引物进行qRT-PCR分析。结果显示为三个独立测量值±S.D.的平均值。B、，使用Dicer、Drosha和β-actin抗体通过Western blot分析血清外泌体。将ExoQuick纯化材料按1:10的比例（TNE-50+0.1%Nonide P-40）稀释，通过Sephadex G-10自旋柱，并通过Western blot分析。
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