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.2013年7月1日;305(1):F100-10。
doi:10.1152/ajprenal.00582.2012。 Epub 2013年5月8日。

Zyxin通过激活肝细胞核因子-1β调节肾上皮细胞迁移

附属公司

Zyxin通过激活肝细胞核因子-1β调节肾上皮细胞的迁移

蔡云和等。 美国生理学杂志肾脏生理学. .

摘要

肝细胞核因子-1β(HNF-1β)是一种上皮组织特异性转录因子,调节肾脏、肝脏、胰腺、肠道和其他器官的基因表达。人类HNF-1β突变会产生肾囊肿和先天性肾脏异常。在这里,我们确定LIM-域蛋白zyxin是肾上皮细胞中HNF-1β的新结合伙伴。Zyxin穿梭至细胞核,与HNF-1β共定位。在钩端霉素B处理的细胞中酵素的免疫沉淀导致HNF-1β的共沉淀。蛋白质相互作用需要zyxin的第二个LIM结构域和HNF-1β的两个不同结构域。过表达zyxin会刺激HNF-1β的转录活性,而小干扰RNA沉默zyxin会抑制HNF-1α依赖的转录。表皮生长因子(EGF)诱导zyxin易位进入细胞核并刺激HNF-1β依赖性启动子活性。EGF介导的zyxin核转位需要激活Akt。显性阴性突变体HNF-1β的表达、zyxin的敲除或Akt的抑制抑制EGF刺激的细胞迁移。这些发现揭示了一种新的途径,通过这种途径,细胞外信号被传递到细胞核,以调节肾上皮分化所必需的转录因子的活性。

关键词:细胞运动;表皮生长因子;蛋白质相互作用;转录。

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数字

图1。
图1。
Zyxin与肝细胞核因子-1β(HNF-1β)相互作用。A类:酵母被单独编码LexA-HNF-1β的质粒转化(1),仅zyxin-激活域(AD)(2)或LexA-HNF-1β和zyxin-AD()生长在含有组氨酸的平板(+His)或缺乏组氨酸的培养基(-His)上。B类:HEK293T细胞与编码MYC-标记的zyxin和/或FLAG-标记的HNF-1β的质粒共转染,并在没有或存在钩体霉素B的情况下培养(5 h,20 ng/ml)。用抗FLAG抗体免疫沉淀细胞裂解物(IP),用抗MYC和抗FLAG的抗体免疫印迹检测共沉淀产物。输入控件显示在底部.MW,分子量。C类:mIMCD3细胞在存在或不存在钩体霉素B(20 ng/ml)的情况下培养5 h,并制备全细胞裂解物(W)和核提取物(N)。用抗发酵素抗体免疫沉淀内源性发酵素,用免疫印迹法检测共沉淀的HNF-1β。Western blot以抗GAPDH作为细胞溶质标记物,抗层粘连蛋白a抗体作为核标记物来验证分馏。C、 胞质的。D类:用编码GFP-zyxin的质粒转染mIMCD3细胞,并用钩端霉素B(20 ng/ml)处理2 h(底部)或未经治疗(顶部).陆军部DH(决断高度):GFP荧光(陆军部),抗HNF-1β抗体染色(数据库DF公司),细胞核用DAPI复染(直流DG公司)、和合并的图像(尽职调查DH(决断高度)). 箭头表示在钩端霉素B处理细胞的细胞核中,zyxin和HNF-1β共定位。比例尺=20μm。
图2。
图2。
绘制HNF-1β和zyxin的相互作用域。A类:全长zyxin和缺失突变体示意图。B类:HEK293T细胞与编码FLAG标记的HNF-1β和MYC标记的zyxin缺失突变体的质粒共转染。用抗FLAG抗体免疫沉淀细胞裂解物,用抗MYC抗体免疫印迹法鉴定与HNF-1β相关的酶切蛋白片段。泳道的编号对应于A.底部:全细胞裂解物中蛋白质的表达水平。C类:缺少第二个LIM结构域的酶蛋白突变体示意图如所示左边将mIMCD3细胞与编码FLAG标记的HNF-1β和MYC标记的zyxin缺失突变体的质粒共转染。用抗FLAG抗体免疫沉淀细胞裂解物,用抗MYC抗体检测印迹。仅转染FLAG标记的HNF-1β质粒的细胞作为对照(CTL)。D类:全长HNF-1β和缺失突变体示意图。E类:HEK293T细胞与编码MYC标记的全长zyxin和FLAG标记的HNF-1β缺失突变体的质粒共转染。用抗MYC抗体免疫沉淀Zyxin,用抗FLAG抗体免疫印迹检测共沉淀HNF-1β片段。全细胞裂解物中蛋白质的表达如所示底部.
图3。
图3。
Zyxin增强HNF-1β的转录活性。A类:HeLa细胞与荧光素酶报告质粒共转染,该报告质粒含有第1页启动子和表达质粒单独编码HNF-1β、zyxin或同时编码HNF1β和zyxin。转染48小时后测定荧光素酶活性。转染HNF-1β和zyxin的细胞中荧光素酶活性增加,但不单独转染zyxin*P(P)与pcDNA相比,<0.05**P(P)< 0.05.B类:mIMCD3细胞与编码酵素的质粒数量增加以及含有野生型荧光素酶报告质粒的恒定数量共同转染第1页启动子(实心条)或含有阻止HNF-1β结合的点突变的突变启动子(灰色条)。Zyxin对野生型启动子产生剂量依赖性刺激,但对突变启动子没有影响*P(P)< 0.05.C类:使用抗酶联蛋白抗体从mIMCD3细胞中免疫沉淀内源性酶联蛋白,并用抗HNF-1β或抗CREB结合蛋白(CBP)抗体通过Western blotting检测共沉淀蛋白。底部:在全细胞裂解物中表达。结果代表了3个独立实验的平均值。误差条指示SD。
图4。
图4。
小干扰(si)RNA介导的zyxin敲除降低HNF-1β的转录活性。A类:mIMCD3细胞用越来越多的zyxin siRNA转染,并用抗zyxin抗体进行Western印迹分析。底部:α-肌动蛋白的蛋白质印迹作为对照。B类:mIMCD3细胞转染了更多靶向zyxin的siRNA。24小时后,细胞被转染第1页启动子荧光素酶报告质粒,36h后测定荧光素素酶活性。C类:用对照siRNA或zyxin siRNA转染mIMCD3细胞。60h后,内源性第1页mRNA转录物通过实时RT-PCR定量。结果代表3个独立实验的平均值。误差条指示SD*P(P)< 0.05.
图5。
图5。
Zyxin在cGMP和EGF的作用下转位到细胞核。A类:mIMCD3细胞用8-溴-cGMP(100 nM)、二丁基cAMP(100 nM)或EGF(100 ng/ml)处理指定的时间段。核提取物用抗酵素和抗层粘连蛋白A抗体进行Western印迹。LMB,钩端霉素B。B类:稳定转染的mIMCD3细胞包含染色体整合第1页-将Gal4-VP16转基因与pcDNA或pCMV-MYC-zyxin和Gal4-荧光素酶报告质粒共转染。24小时后,用EGF(100 ng/ml)处理细胞16小时(开放栏)或载体(封闭栏)。转染40 h后测定荧光素酶活性。C类:mIMCD3细胞在有或无LY294002(50μM)的情况下用EGF(100 ng/ml)处理指定的时间段。细胞裂解物用抗Akt和抗磷酸化Akt抗体进行Western印迹。D类:在LY294002(50μM)存在或不存在的情况下,用EGF处理mIMCD3细胞。用抗酶蛋白抗体进行Western blotting检测核提取物中酶蛋白的积累。拉明A被用作核标记蛋白。抗-GAPDH和抗层粘连蛋白A抗体被用作细胞溶质和核组分纯度的标记(A类D类). 结果代表3个独立实验的平均值。误差条指示SD*P(P)< 0.05.
图6。
图6。
显性阴性突变体HNF-1β的表达或zyxin的敲除抑制EGF刺激的细胞迁移。A类:53A细胞生长汇合,并用米非司酮处理48小时,以诱导DN-HNF-β或乙醇的表达作为对照。用吸管尖端划伤(),细胞在没有培养基的情况下培养15小时(b条d日)或存在(c(c)e(电子))EGF的浓度(100 ng/ml)。B类:测量伤口面积,并使用ImageJ软件计算伤口愈合百分比。C类:用对照siRNA转染的mIMCD3细胞的融合单层(b条)或zyxin siRNA(c(c)(f)小时k个)被吸管尖头刮伤()在不存在的情况下培养15小时(b条(f))或存在(k个)EGF的浓度(100 ng/ml)。D类:测量伤口面积,并使用ImageJ软件计算伤口愈合百分比。E类:mIMCD3细胞被打乱的siRNA或四种不同的靶向zyxin的siRNA转染,并用抗zyxim抗体和抗tubulin抗体进行Western blot分析。F类:转染干扰siRNA或2种不同siRNA对抗zyxin的mIMCD3细胞的增殖率。结果代表3个独立实验的平均值。误差条显示SD。显微照片是使用AxioObserver FL显微镜以10倍放大率采集的*P(P)与对照组相比,<0.05。比例尺=30μm。
图7。
图7。
Akt的抑制抑制HNF-1β转录活性细胞迁移和与第1页发起人。A类:mIMCD3细胞与增加浓度的MK-2206孵育24小时。细胞裂解物用抗pAkt、Akt,Zyxin、pZyxin和GAPDH抗体进行Western blot分析。B类:mIMCD3细胞转染了第1页启动子荧光素酶报告质粒。细胞与MK-2206单独或与EGF联合培养16小时。转染48小时后测量荧光素酶活性。C类:用MK-2206或载体处理的mIMCD3细胞的融合单层通过吸管尖端刮伤()在不存在的情况下培养15小时(b条c(c))或存在(d日e(电子))EGF的。D类:测量伤口面积,并使用ImageJ软件计算伤口愈合百分比。E类,左边:第1页基因及其上游启动子。箭头所示为HNF-1β结合位点侧翼的引物。mIMCD3细胞单独用EGF(100 ng/ml)或在MK-2206(5μM)存在下孵育20 h。用抗HNF-1β抗体或IgG作为阴性对照进行染色质免疫沉淀(ChIP),然后用抗磷酸化酶(pZyxin)抗体进行第二轮免疫沉淀。第一轮(右上)和第二轮(右下角)用PCR分析免疫沉淀DNA。第1轮使用IgG免疫沉淀,第2轮使用抗pZyxin抗体作为附加阴性对照(N-CTL)。给出了3个独立实验的代表性结果。误差条显示SD。使用AxioObserver FL显微镜在×10放大倍数下获取显微照片*P(P)< 0.05. 比例尺=30μm。

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