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.2013年6月14日；288（24）：17713-24。
doi:10.1074/jbc。M112.445403。 Epub 2013年5月7日。

胞外体摄取依赖于ERK1/2-热休克蛋白27信号转导和脂质Raft介导的胞内吞受小窝蛋白-1负调控

凯特琳·J·斯文森 1, 海伦娜·克里斯蒂安森, 安德斯·维特鲁普, 埃里卡·布肖·吉尔曼, 伊娃·林德奎斯特, Lena M Svensson女士, 马蒂亚斯·莫尔盖林, 马蒂亚斯皮带
附属公司

胞外体摄取依赖于ERK1/2-热休克蛋白27信号转导和脂质Raft介导的胞内吞受小窝蛋白-1负调控

凯特琳·J·斯文森等。 生物化学杂志. .

摘要

外泌体在癌症中的作用可以从其转移肿瘤细胞衍生的遗传物质和信号蛋白的观察中推断出来，从而导致肿瘤血管生成和转移增加。然而，与这些病毒样颗粒的摄取有关的膜转运机制和信号事件仍不明确。我们现在报道，来自胶质母细胞瘤（GBM）细胞的外泌体内化涉及非经典的、脂筏依赖性的内吞作用。重要的是，我们发现脂筏相关蛋白小窝蛋白-1（CAV1）与之前描述的病毒摄取作用类似，对外泌体的摄取具有负调控作用。我们发现外泌体诱导几个已知与脂筏相关的下游靶标的磷酸化，作为信号传导和分选平台，如细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）和热休克蛋白27（HSP27）。有趣的是，外体摄取似乎依赖于未受干扰的ERK1/2-HPS27信号，并且在外体内化过程中，ERK1/2磷酸化受到CAV1的负面影响。这些发现大大提高了我们对外泌体介导的摄取的一般理解，并为如何通过调节CAV1表达和ERK1/2信号来靶向该途径提供了潜在的策略。

关键词：小泡蛋白；细胞内吞；外显子；胶质母细胞瘤；微泡；囊泡。

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数字

图1。
图1。
GBM细胞衍生的胞外体样细胞外囊泡的胞内作用。 A类，通过纳米粒子追踪分析表征U87 MG衍生囊泡。B电子显微镜证实了完整的囊泡。比例尺，100 nm。C类外体标记CD63、TF、flotillin-1和ER标记calnexin的细胞和外体样囊泡免疫印迹分析。D类共聚焦显微镜分析在没有或存在过量（×4）未标记外显体的情况下外显体摄取。比例尺，15μm。E类和F类，时间(E类)、和浓度(F类)-流式细胞术分析外源体的依赖性摄取。G公司，在4°C时，外泌体的被动摄取微不足道。H（H）人子宫颈腺癌细胞（HeLa）、中国仓鼠卵巢细胞（CHO K1）、小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）、U87 MG和HUVEC细胞的胞外体摄取(n个= 3). 将值归一化为HUVEC（=1）。控制(控制)代表没有外泌体的细胞。流式细胞仪图表示产生类似结果的两个代表性实验之一的平均荧光值，误差线为±S.D。；a.u.，任意单位。我，外泌体沿着微管轨道移动。将pIRESneo-EGFP-α-微管蛋白转染COS-7细胞24小时后，再加入PKH26标记的外泌体，再转染16小时。外泌物转运的视频序列显示（4个装箱的单独图像，0秒，12秒，25秒，54秒）(黄色的)沿微管(白色).箭头描绘了细胞内的、可运动的外泌体。使用C-Apochro 20X/0.8 M27物镜、4.0变焦、31μm针孔设置和5.5%（561 nm）和5%（488 nm）的激光增益拍摄图像。图像大小为x:512，y:512。图像拍摄时间为2分钟和11秒。比例尺为20μm。有关全长电影，请参见补充视频S2.J型，在用10μg/ml诺可唑处理10分钟的HUVECs中减少了外泌体运输(下部面板)与对照组相比（无治疗，上部面板). 所示图片（外显子运动）表示外显子在叠加中运动时间序列的彩色编码数据，其中每个时间点（在40秒内）对应一种颜色。使用C-Apochro 63X/1.20W korr M27物镜（缩放3.6）拍摄图像。比例尺，50μm。有关长篇电影，请参阅补充视频S3和S4.K（K）nocodazole（10μg/ml）处理10min后，用台盼蓝排斥法测定细胞存活率。L（左）随着时间的推移，带有内含组织因子（TF）的外泌体的腔室的电子显微镜图像。低放大率概述(上部面板，比例尺，100μm）证实了外泌体的胞内定位和裁剪图片(下部面板，标尺，100 nm）显示腔内小泡(红色箭头)α-TF 5 nm金粒子阳性。注意，HUVEC中的内源性囊泡结构对TF是阴性的(左下面板,白色箭头).M（M）α-TF 5 nm金颗粒检测到的GBM细胞源性外泌体的HUVEC和抗TSG101 15 nm金颗粒区分的MVB的电子显微镜共定位研究（标尺，100μm）。控制：不添加外泌体。N–O型外泌体在长期培养（24小时）后位于CD63阳性的隔室中，但在细胞表面不与CD63共定位。稳定表达CD63-mCherry的U87MG细胞(N个)或瞬时转染CD63-GFP(O（运行）)与PKH标记的外泌体孵育指定时间段。在1中清洗细胞米NaCl和PBS在固定和共焦显微镜分析之前去除非特定结合的外显体。CD63型(绿松石)和内化外泌体(红色)在指定的时间点捕获。比例尺，15μm。
图2。
图2。
外泌体的内分泌摄取需要完整的脂质膜筏。 A类共聚焦显微镜分析显示Tfn没有共定位(绿松石,上部面板)或AcLDL(红色,下部面板)带有外泌体(红色/绿松石)30分钟时，标尺为15μm。B，使用针对网格蛋白的siRNA对网格蛋白重链的敲除验证(硅碎屑)与阴性对照序列相比(硅NT)并归一化为α-微管蛋白(C类).D类，外泌体摄取的流式细胞术分析显示，与si-NT转染的细胞相比，si-Clath没有差异。E类共聚焦显微镜分析显示CtxB（绿松石）和外泌体的共定位(红色)在HUVEC中摄取30分钟(上部面板)和U87 MG电池(下部面板). 比例尺，15μm。F类共聚焦显微镜分析显示Dx10的共定位有限(绿松石)和外泌体(红色)在HUVEC中摄取30分钟。比例尺，15μm。G公司，加权共定位系数显示CtxB和外泌体的共定位为20%（平均值），外泌体和10kDa右旋糖酐（Dx10）的共定位约为15%。计算结肠化系数（Dx10/exosomes，n个=23个单元格；CtxB/外泌体，n个=22个单元）。*，第页= 0.0182. 所有图像均使用C-Apochro 63X/1.20W korr M27物镜拍摄，两种激光器的激光增益均为6.0%。H（H），大胞饮抑制剂阿米洛利（100μ米)减少Dx10摄取（*，第页=0.01），而Tfn摄取受影响较小。我在较宽的浓度范围内，阿米洛利对胞外体摄取没有显著影响。J型和K（K），胆固醇消耗药物MβCD剂量依赖性地抑制外体摄取。J型、HUVEC(第页值，*，0.005，**，0.0023，***，0.0008）；K（K），U87 MG电池（*，第页= 0.068).L（左），Tfn的摄取不受MβCD的影响（2.5 M米)而CtxB和胞外体的摄取减少，表明对脂筏依赖性摄取的特异性抑制(第页值，*，0.0006，**，0.02）。M（M），辛伐他汀剂量依赖性抑制外泌体摄取(第页值，*，0.014，**，0.011）。N个，filipin III对脂筏的隔离实质上抑制了胞外体的摄取(左侧面板)而Dx10(中间面板)和Tfn(右侧面板)摄入受影响较小（*，第页= 0.001). 给出的图表显示了三个代表性实验之一的平均荧光值（10000个事件/样本）(n个=3）结果相似±S.D。
图3。
图3。
外显子内化受CAV1负调控。 A类，野生型小鼠胚胎成纤维细胞(MEF重量)和cav-1基因敲除小鼠（MEF cav-1（−/−））分析CAV1蛋白。B共聚焦图像显示外泌体摄取增加(红色)与MEF WT细胞相比，MEF cav-1（−/−）。比例尺，15μm。C类图中显示了流式细胞术对MEF WT和MEF cav-1（−/−）细胞外显子摄取的定量测量，并表示三个独立实验的平均荧光值（20000个事件/样本）(n个=9）±S.D.（*，第页= 0.000003).D类，通过慢病毒shRNA转导在U87 MG细胞中稳定击倒CAV1（约80%）。E类，流式细胞术分析显示外显子摄取增加(左侧面板)，Tfn摄取无显著差异(中间面板)和Dx10摄取减少(右侧面板)在CAV1 shRNA细胞中，与转染对照shRNA（shRNA NC）的细胞相比。图表表示三个代表性实验之一的平均荧光值（20000个事件/样本）(n个=4）±S.D.（*，第页=0.0019英寸左侧面板).F类流式细胞术分析CAV1-YFP转染效率；MEF重量(灰色区域)，MEF cav-1（−/−）(黑线)，和转染pEX_EF1_CAV1-YFP质粒的MEF cav-1（−/−）细胞(灰色线条).G公司，将CAV1-YFP引入MEF cav-1（−/−）细胞（YFP，绿松石)减少外泌体的摄取(红色). 注意高CAV1-YFP表达细胞(箭头)与低CAV1-YFP表达细胞相比，外显体摄取减少。比例尺，15μm。H（H）外显子摄取的点图分析与CAV1-YFP在MEF细胞中的表达。我，摄入的量化H（H）图形表示代表性实验的平均荧光值（20000个事件/样本）(n个=4）±S.D.（*，第页= 0.0009).J型，用CAV1-YFP稳定转染的HeLa细胞中CAV1的免疫印迹。K（K）与HeLa WT细胞相比，CAV1过度表达HeLa细胞中外显体的摄取减少。L（左），短暂CAV1过度表达U87 MG细胞中外泌体摄取减少(左侧面板)和CHO-K1细胞(右侧面板)与瞬时转染eGFP的对照细胞相比。图表表示两个独立实验中的一个的平均荧光值（20000个事件/样本）(n个=3）±S.D.（*，第页= 0.018).M（M），CAV1-YFP（绿松石）和外泌体之间无共定位(红色)使用共焦显微镜分析。比例尺，15μm。N个，CAV1-YFP之间没有协同定位(绿色)和外泌体(红色)使用TIRF显微镜分析。比例尺，10μm。O（运行）α-TF 30 nm金颗粒检测到的外泌体和抗浮蛋白-1 10 nm金颗粒识别的脂筏在HUVEC中的电子显微镜共定位研究。比例尺，100μm。左侧面板:控制，不添加外泌体。
图4。
图4。
外显子内化依赖于ERK1/2和HSP27信号通路的激活和完整的细胞骨架。 A类未经处理的HUVEC中磷酸化激酶的水平(控制)或与外泌体孵育10分钟(10分钟Exo)或30分钟(30分钟Exo). 作为比较，使用相同数量的外泌体蛋白来可视化外泌体内的磷酸蛋白(Exo含量).B，平均值的量化(n个每个印迹中=2）p-ERK1/2、p-MSK1/2、p-HSP27和p-FAK相关未刺激细胞(控制).C类在没有或存在U0126的情况下，有或没有外显体刺激的p-ERK1/2的相对蛋白水平。D类，减少U0126处理的HUVEC的外显子摄取。图表示三个独立实验之一的平均荧光值（20000个事件/样本）(n个= 3) (*,第页=0.01，**，第页=0.002）±S.D。E类，用两个独立实验之一的平均荧光值（20000个事件/样品）表示U0126处理的HeLa细胞外显子摄取减少(n个= 4) (*,第页=0.000009）±S.D。F类，外泌体对p-HSP27蛋白的诱导被使用U0126的ERK1/2抑制所抵消。G公司，siRNA敲除后HSP27蛋白相对表达的代表性印迹。H（H），减少的外体(红色)HSP27击倒细胞的摄取。白色，f-actin；蓝色，原子核。比例尺，15μm。我，流式细胞术分析H（H）来自一个典型的实验(n个= 4) (*,第页=0.002）±S.D。J型HSP27 siRNA和siRNA-NT转染细胞中肌动蛋白细胞骨架-类卵磷脂染色。注意siHSP27转染细胞的细胞骨架异常(右侧面板,红色箭头). 比例尺，100μm。K（K）定量分析细胞骨架异常的平均细胞数与七个独立显微视野中计数的细胞总数的关系；siNT细胞(n个=116）和siHSP27敲除细胞(n个= 209). 数据为平均值±S.D.（*，第页= 0.00018).L（左）肌动蛋白细胞骨架（f-actin，白色)使用0.5μ米细胞松弛素D或Lantrunculin A.比例尺，100μm。M（M）和N个不同浓度的细胞分裂素D处理的细胞对胞外体的摄取(M（M）)或Lantrunculin A(N个). 图为两个结果相似的独立实验的平均荧光值（10000个事件/样品）±S.D。所有值（*）与对照组（0μ米)带有第页值<0.0001。
图5。
图5。
CAV1负调节ERK1/2依赖性外泌体的内吞作用。 A类图中所示为MEF WT和MEF cav-1（−/−）细胞中p-ERK1/2和总ERK1/2（t-ERK1/2）的代表性印迹(左侧面板)，以及相对蛋白质水平的量化(右侧面板).B，逆转U0126在MEF细胞中通过外显体介导的p-ERK1/2诱导。图中显示了Western blot分析的量化。C类ERK1/2抑制可抵消CAV1缺陷细胞外泌体摄取的上调。图表表示三个独立实验之一的平均荧光值（20000个事件/样本），结果类似±S.D.*，第页=0.02，**，第页= 0.00001.D类CAV1-YFP的过度表达抑制了外泌体介导的HeLa细胞中p-ERK1/2和p-HSP27的诱导。所示为p-ERK1/2、t-ERK1/2，p-HSP27，总HSP27和微管蛋白的代表性斑点(上部面板)和相对蛋白质水平的量化(下部面板)在HeLa WT和CAV1-YFP细胞中用外泌体刺激指定时间。E类，本研究主要发现的示意图。外显子通过脂筏相关的内吞作用内化，该内吞作用受CAV1阴性控制。涉及的其他信号蛋白是ERK1/2和HSP27，可能还有其他ERK1/2下游靶点。众所周知，HSP27参与肌动蛋白细胞骨架的重排，对内吞过程中质膜的内陷至关重要。
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