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.2013年5月1日;33(18):7997-8008.
doi:10.1523/JNEUROSCI.5661-12.2013。

PTEN核转位增加在兴奋性毒性和缺血性神经元损伤中的关键作用

附属公司

PTEN核转位增加在兴奋性毒性和缺血性神经元损伤中的关键作用

舒张(Shu Zhang)等。 神经科学. .

摘要

中风是发达国家致残的主要原因。然而,在发病后3小时后没有可用的治疗方法。在此,我们报告PTEN(染色体TEN上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物)的核移位是一个延迟步骤,可导致兴奋性毒性(体外)和缺血性(体内)神经元损伤。我们发现,N-甲基-d-天冬氨酸(NMDA)的兴奋毒性刺激导致培养神经元中PTEN核移位,这一过程需要赖氨酸13残基(K13)的单-双肽化,因为K13突变或位于K13残基两侧的短干扰肽(Tat-K13)阻止了移位。更重要的是,使用大鼠局灶性缺血模型,我们证明,即使在中风后6小时,全身应用Tat-K13,不仅可以减少缺血诱导的PTEN核移位,而且还可以强烈保护大脑免受缺血性损伤。我们的研究表明,抑制PTEN核转位可能是中风治疗后的一种新方法。

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图1。
图1。
兴奋毒性NMDA刺激增加培养神经元PTEN核移位。A类,B类在浴液中应用NMDA(25μm,持续1小时,再加上6小时的恢复)会导致显著的神经元死亡,表现为核浓缩/碎片化的神经元数量增加。比例尺,20μm。(图2C类以及细胞外LDH水平升高(B类,n个=每组7个培养皿,来自7个独立实验)。NMDAR拮抗剂AP5(50μ).C类细胞质和细胞核组分的Western blotting显示,NMDA刺激(25μm刺激1 h,再加上6 h恢复)可增强PTEN向细胞核的转运,这一过程可被AP5(50μm)抑制). 我们通过依次用细胞质标记Hsp90和核标记层粘连蛋白B1重制印迹来确认细胞质/细胞核分馏的质量。底部的条形图总结了四个独立实验的数据。D类核(N-PTEN)和细胞质(C-PTEN)组分的Western blotting表明,PTEN核转位增强主要由含NR2B的NMDARs(NR2BR)介导,因为NR2B拮抗剂Ro25-6981(Ro;0.5μ)但不含NR2A的NMDAR偏好拮抗剂NVP-AAM077(NVP;0.4μ).E类对PTEN(N-PTEN)和核标记物(TBP)的核组分进行序贯检测表明,NMDA诱导的PTEN核转位具有时间依赖性,在刺激后6~9 h达到峰值,24 h内恢复到基线水平;n个=每组2个培养皿,来自两个独立实验。值得注意的是,NMDA诱导的PTEN核移位的时间进程与缺血诱导的时间进程略有不同(图3A类),可能是由于不同的刺激强度。F类,PIP核级分的顺序点印迹(N-PIP)和核蛋白NeuN(NeuN)显示,NMDA刺激(25μm持续1小时,外加6小时恢复)导致PIP的核水平显著下降PTEN的主要生理底物;n个=每组5个培养皿。G公司,磷酸-Akt核组分的顺序印迹Ser473系列(N-p-Akt)和总Akt(N-total-Akt)表明,NMDA处理(25μm,1 h,加上9 h恢复)导致磷酸化Akt的核水平显著降低Ser473系列;n个=每组3个培养皿。H(H),核PTEN活性对NMDA诱导的神经元损伤至关重要。神经元死亡的图像(左)和量化(右)显示,NMDA刺激后6小时(1小时内25μm)的核浓缩分析表明,核靶向磷酸酯酶死亡PTEN突变(NLS-GFP-PTEN)的过度表达显著降低了NMDA诱导的神经元死亡C124S型)但不是通过GFP或核靶向野生型PTEN(NLS-GFP-PTEN)的过度表达重量);n个=每组12个培养孔,从三个独立实验中计算每个培养孔中的25个神经元。比例尺,20μm。条形代表组平均值,误差条形代表SD。临时的通过显著的单因素方差分析或Kruskal–Wallis等级分析,将治疗组与对照组进行比较,显著性定义为*第页< 0.05, **第页<0.01。
图2。
图2。
PTEN K13在NMDA诱导的培养神经元PTEN核移位和神经元死亡中的关键作用。A类PTEN的残基对神经元中PTEN核的积累至关重要。图像(顶部面板)和核荧光强度鉴定(底部条形图;n个=每组33个细胞,来自三个独立实验)证明GFP-PTEN的GFP信号K13R系列突变体主要是细胞质的,被排除在细胞核之外,而两种类型PTEN(GFP-PTEN)的GFP信号重量)或K289R突变型(GFP-PTENK289R公路)在细胞核和细胞质中分布相对均匀。比例尺,20μm。B类,用干扰肽Tat-K13(10μ),但不是Tat-K289(10μ),完全阻断NMDA刺激的PTEN核转位,如核部分的免疫印迹所示(n个=每组4个培养皿,来自四个独立实验)。NMDA刺激后6 h进行细胞核分馏(25μm持续1 h)。C类,D类,Tat-K13可防止NMDA诱导的兴奋毒性。Tat-K13(10μ),但不是对照肽Tat-K289(10μ),减少显示细胞核凝聚/分裂的神经元数量(C类,n个=每组8个培养孔,从三个独立的实验中,从每个培养孔中随机选择四个视野并取平均值;比例尺,20μm)和减少LDH释放(D类,n个=每组27个培养孔,来自三个独立实验)。两种测定均在NMDA刺激后6小时进行(25μm,持续1小时)。E类,体外PTEN脂质磷酸酶活性测定显示,在测试浓度(10μ)干扰肽Tat-K13和对照肽Tat-K289均未对脂质底物PIP产生游离磷酸盐产生显著影响通过重组PTEN(n个= 3). 条形代表组平均值,误差条形代表SD。临时的通过显著的单因素方差分析或Kruskal–Wallis等级分析,将治疗组与对照组进行比较,显著性定义为*第页< 0.05, **第页<0.01。
图3。
图3。
PTEN核转位增强导致局灶性脑缺血损伤后缺血性神经元损伤体内成熟的Sprague-Dawley大鼠通过短暂结扎右侧MCA和双侧CCA,接受90分钟局灶性缺血事件的挑战,然后按照指示恢复不同的时间段。A类缺血损伤在梗死皮质区触发了时间依赖性PTEN核移位。左侧,第7天从一只经盐处理的对照卒中大鼠身上拍摄的MRI代表性冠状扫描图像显示了一个清晰的梗死(白色)区域。右侧,在卒中后不同时间点对梗死区(左侧为白色方形区域)的PTEN和核蛋白层粘连B1的细胞核分数进行连续探测,结果显示PTEN核易位随时间增加,在卒中12小时后达到峰值,24小时内恢复到基线水平(n个=每组2只大鼠)。B类,系统应用Tat-K13可有效进入大脑中的神经元,包括缺血半影区的神经元。脑卒中后6 h应用荧光肽Tat-K13-Carboryfluorescein(10 mg/kg,静脉注射),1 h后处理脑切片。左图,氯化三苯基四氮唑(TTC)染色图像(1mm厚的冠状脑切片)显示大脑损伤侧的感觉运动皮层可见梗死区。右侧,荧光显微镜图像取自紧邻左侧TTC染色切片的切片。1毫米厚脑切片中梗死区的图像(放大2.5倍)与左侧TTC切片中的白框所示的区域相对应,显示肽不仅进入大脑,而且似乎在梗死区特别富集。高倍放大(20倍或40倍)拍摄的梗死区20μm厚的脑切片图像进一步证实了该肽成功转导到缺血区的单个细胞中。C类在发作后6小时应用Tat-K13肽可减少中风引发的PTEN核移位。对梗死区PTEN(N-PTEN)和核蛋白层粘连B1的细胞核组分的连续探测表明,在中风后12 h进行检测时,Tat-K13(K13;10 mg/kg,静脉注射),而不是其对照Tat-K13R(K13R;10 mg/kg.静脉注射)显著降低了缺血诱导的PTEN核移位(n个=每组6只大鼠)。D类,在第7天,对大鼠进行90分钟短暂局灶性脑缺血损伤,并按指示接受各种治疗,从嘴侧(顶部)到尾侧(底部)水平拍摄典型的MRI扫描图像。右边的条形图总结了每组10只大鼠的结果。与对照肽Tat-K13R(K13R;10 mg/kg,静脉注射)或Tat-K289(K289;10 mg/kg/kg,静脉滴注)或在中风发作后2 h滴注生理盐水相比,中风发作后第2或6 h滴注Tat-K13(K13;10 mg/kg.)可显著减少梗死面积。E类,FDG-PET扫描在第7天从相同的动物组D类与接受对照肽Tat-K13R或Tat-K289或生理盐水的动物相比,接受Tat-K13的动物梗死区的脑葡萄糖代谢活动显著恢复。色标(左)表示葡萄糖代谢的相对水平,从高(红色)到低(蓝色)。条形代表组平均值,误差条形代表SD。临时的在进行显著的单因素方差分析或Kruskal–Wallis等级分析后,分析比较了治疗组和对照组(生理盐水),显著性定义为*第页< 0.05, **第页<0.01。
图4。
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中风后用Tat-K13肽治疗改善局灶性脑缺血损伤后的运动行为表现体内局部缺血和肽应用如图3所示(n个每组10个)。A类,偏向性身体摆动测试显示,在中风后的4周恢复期内,接受Tat-K13中风后治疗的动物(2小时组和6小时组)表现出比用盐水或对照肽治疗的动物快得多的恢复。B类与生理盐水治疗相比,Tat-K13肽(而非其对照肽)显著促进了中风大鼠运动活动的恢复。在中风后4周的恢复期内,在2小时的观察期内,使用计算机运动箱自动测量运动活动(垂直运动时间)。C类握力测试表明,在中风后28天,接受Tat-K13治疗的动物(2和6小时组)的握力表现比接受对照肽或生理盐水的动物要好得多。总之,这些行为测试表明,Tat-K13肽对改善运动功能具有持久的治疗作用。条形代表组平均值,误差条形代表SD。临时的在进行显著的单因素方差分析或Kruskal–Wallis等级分析后,分析比较了治疗组和对照组(生理盐水),显著性定义为*第页< 0.05, **第页<0.01。

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