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.2013年6月；10(6):557-62.
doi:10.1038/nmeth.2448。 Epub 2013年4月28日。

光学纳米技术中图像分辨率的测量

Robert P J Nieuwenhuizen先生 1, 基思·利德克, 马克·贝茨, 丹妮拉·莱顿·普格, 大卫·格伦沃尔德, 斯乔德·斯塔林加, 伯恩德·里格
附属公司

光学纳米技术中图像分辨率的测量

Robert P J Nieuwenhuizen先生等。 Nat方法. 2013年6月.

摘要

光学纳米显微镜（或超分辨率显微镜）的分辨率取决于单个荧光标记的定位不确定性和密度以及样品的空间结构。目前，还没有一个综合的、实用的解决措施来考虑所有因素。我们介绍了一种基于傅里叶环相关（FRC）的测量方法，该方法可以直接从图像中计算。我们在微管蛋白和肌动蛋白丝的二维（2D）和三维定位显微镜图像上证明了其有效性和益处。我们的FRC分辨率方法可以比较不同纳米复制方法拍摄的图像中获得的分辨率，优化和排序不同的发射器定位和标记策略，定义数据采集的停止标准，描述图像的各向异性和异质性，甚至估计每个发射器的平均定位数。我们的发现挑战了当前对获得最佳定位精度的关注，相反，它显示了如何尽快获得最佳图像分辨率。

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数字

图1
图1。FIRE原理和定位不确定性与标签密度之间的权衡
一，所有定位被分为两半，其傅里叶变换在半径傅里叶空间圆周长上的相关性q个从而产生指示与空间频率的相关性的衰减的FRC曲线。图像分辨率是FRC曲线下降到阈值1/7≈0.143以下的空间频率的倒数，例如阈值为q个=0.04纳米−1相当于25 nm的分辨率b条，线对的模拟定位显微图像，线对所占区域内的平均标记密度ρ=2.5·10三微米−2定位不确定度σ=7.6 nm（线距70 nm，余弦平方横截面如补充注释2所定义）。c（c）、线路对的恒定FIRE值（20、40…、100 nm）的理论（线路）和模拟数据（圆圈），如所示b条作为定位不确定性和线所占区域内标记密度的函数。定位不确定度限制分辨率（蓝色）和标记密度限制分辨率（黄色）区域由红线ρσ分隔2=电子/6π.d日，不同固定总测量时间（1、5、10、20和30分钟）的定位不确定性与图像分辨率。相机帧速率是变化的，以匹配发射器的开启时间。曲线的最小值落在红线FIRE=2πσ上，该红线将没有足够发射器定位的黄色区域与没有足够精确定位发射器的蓝色区域分开。
图2
图2。定位密度和数据处理对分辨率的影响
一，HeLa细胞中标记有Alexa 647的微管蛋白的定位显微镜图像（整个图像的FIRE=58±1 nm）。图像是从1.4·10获得的4在4分钟内记录的帧，在随后的图像帧中合并附近的定位后，定位不确定性为σ=9.7nm（补充方法，第3.3节），定位密度为ρ=6.0·102微米−2.b–e类，两条交叉线的放大插页由较少的时间框架构成，显示较差的分辨率（由蓝色箭头之间的距离表示）。（f），在整个数据采集过程中，FIRE=2πσ，以蓝色绘制，显示了接近数据采集结束时从密度限制分辨率到精度限制分辨率的过渡。在数据采集结束时，我们得出ρσ2=0.06，其数量级为过渡点的经验法则值0.14（参见等式（4））。g–i，不同定位算法的重建表明MLE(克，FIRE=58±1 nm）和LS(小时，FIRE=60±1 nm）方法优于CEN(我，火焰=88±2 nm）。j个，在采集过程中校正了约70–100 nm的样品漂移后，固定HeLa细胞的肌动蛋白细胞骨架（F-actin）的定位显微镜图像，该细胞标记有与Alexa 647偶联的Phalloidin。图像是从5.0·10获得的48分钟内记录的帧，定位不确定性（在后续图像帧中合并附近的定位后）为σ=8.0nm，定位密度为ρ=8.2·10三微米−2(ρσ2=0.52，2πσ=50 nm）。k–n（k–n），缩放之前的重建插入(k、 米)以及之后(l、 n个)漂移校正表明，漂移校正后可以看到更多细节，这反映在漂移校正后整个图像的FIRE值更好（54±1nm，而漂移校正前为79±2nm）。
图3
图3。双色定位显微图像的伪相关
a、 b条，微管蛋白网络概览图(一)标有Alexa 647（红色）和Alexa 750（绿色），并插入(b条)显示注册质量。c（c），红通道和绿通道的未修正FRC曲线显著高于交叉通道曲线，这是由于单个发射器重复光激活产生的伪相关，导致红色和绿色通道的FIRE值过于乐观（分别为25±1 nm和34±1 nm，而交叉通道为118±2 nm）。d日，经伪相关校正的FRC曲线彼此更接近，并产生类似的FIRE值（Alexa 647为108±1 nm，Alexa 750为133±2 nm，交叉信道为121±2纳米）。e–g，标度FRC分子曲线显示了中间空间频率的平台，用于估计校正项和参数问确定每个绑定站点的平均本地化数量(问对于Alexa 647＝10，问Alexa 750=18，问=0.3（对于交叉通道）。对于这种校正（见补充方法，第1节），我们使用了定位不确定度分布的平均值和宽度，Alexa 647的不确定度为9.2和2.8 nm，Alexa750的不确定程度为12和2.0 nm。
图4
图4。3D-消防
一微管蛋白网络三维定位显微镜图像的傅里叶平面相关（FPC）正交切片。b–d，横截面q个x个q个z（z）-飞机q个年q个z（z）-飞机，以及q个x个q个年-傅里叶平面相关平面，增加了分辨率阈值轮廓柔性线路板=1/7（黑线）。电子，表示三维微管蛋白网络，轴坐标为假彩色。FPC清楚地显示了由灯丝的线状结构（垂直于灯丝的最高图像分辨率）以及定位不确定性的各向异性（轴向的最低分辨率）导致的图像内容各向异性。
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