A nucleus-targeted alternately spliced Nix/Bnip3L protein isoform modifies nuclear factor κB (NFκB)-mediated cardiac transcription

doi:10.1074/jbc.M113.452342

.2013年5月31日；288（22）：15455-65。

doi:10.1074/jbc。M113.452342。 Epub 2013年4月19日。

核靶向交替剪接Nix/Bnip3L蛋白亚型修饰核因子κB（NFκB）介导的心脏转录

陈云（音）¹, 基思·F·戴克, 大理正, 斯科特·J·马特科维奇, 李佳, 杰拉尔德·多恩第二

附属公司

PMID： 23603904
预防性维修识别码：项目经理3668707
内政部： 10.1074/jbc。M113.452342号

核靶向交替剪接Nix/Bnip3L蛋白亚型修饰核因子κB（NFκB）介导的心脏转录

陈云（音）等。生物化学杂志. 2013.

.2013年5月31日；288(22):15455-65.

doi:10.1074/jbc。M113.452342。 Epub 2013年4月19日。

作者

陈云（音）¹, 基思·F·戴克, 大理正, 斯科特·J·马特科维奇, 李佳, 杰拉尔德·多恩第二

附属

¹美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院医学系药物基因组学中心，邮编63110。

PMID： 23603904
预防性维修识别码：项目经理3668707
内政部： 10.1074/jbc。M113.452342美元

摘要

一些Bcl2家族蛋白以线粒体靶向全长和细胞溶质截短交替剪接异构体的形式表达。重组表达的短Bcl2家族亚型可以异型结合并阻止其全长类似物的线粒体定位，从而通过隔离抑制其活性。这种“海绵”作用需要1:1的表达化学计量比；如果没有这一点，建议换一个角色。此处，RNA测序显示心脏中BH3-only蛋白Nix/Bnip3L（Nix）及其交替剪接可溶性形式（sNix）的协同调节，但sNix/Nix的相对表达为～1:10。因此，我们研究了sNix的其他假定功能。尽管Nix在H9c2大鼠成肌细胞中表达，定位于线粒体，但sNix表现出可变的细胞质和细胞核分布。肿瘤坏死因子α（TNFα）诱导快速完整的sNix核质易位，同时伴有NFκB的p65/RelA亚单位的核易位。TNFα刺激后sNix与p65/RelA共定位共沉淀；TNFα诱导的sNix核移位在p65/RelA缺失的小鼠胚胎成纤维细胞中没有发生。TNFα刺激的H9c2细胞的ChIP测序显示，sNix抑制p65/RelA与弱DNA结合位点的结合，这解释了其改变培养细胞和小鼠体内心脏基因表达的能力。这些发现揭示了TNFα刺激的非线粒体Nix亚型交替剪接的细胞质-核穿梭，并揭示了sNix作为TNFα/NFκB刺激的心脏基因表达调节剂的作用。sNix和Nix的转录共同调节，以及TNFα对sNix的翻译后调节，包含了一种以前未知的外源性死亡受体和内源性线粒体凋亡途径之间分子相互作用的机制。

关键词：Bcl-2家族蛋白质类；心血管疾病；基因调控；NF-kappa B（NF-KB）；肿瘤坏死因子；sNix公司。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**交替mRNA剪接亚型sNix在心肌肥厚中受到调节。** A类，描绘sNix和Nix cDNA结构的示意图。这个*白色盒子*在sNix开放阅读框内是一个替代外显子，编码一个早期TAA终止密码子（不精确）。B类,顶部，sNix和Nix C末端区域的对齐cDNA核苷酸序列显示交替拼接插入(红色)和终止密码子的位置(绿色).底部，对应的对齐氨基酸序列。C类，乙二醇染色凝胶显示非转基因的sNix和Nix PCR产物(*新台币*)和Gα_问转基因(*Gq公司*)心脏；跨越交替外显子的PCR引物的位置如下所示箭头在里面*B、D类*，定量sNix(左边)和镍(*正确的*)非转基因RNA序列测定mRNA表达(白色)和Gα_问(黑色)心脏(n个=每个4个，*=第页< 0.05).E类，免疫印迹分析显示两个非转基因和两个Gα中线粒体Nix和细胞溶质sNix蛋白水平_问红心。使用ImageJ进行蛋白质定量，并分别使用COX IV和GAPDH进行标准化。F类，定量分析Bcl2家族其他成员的剪接异构体表达，如D类.

**图2。**
**sNix核转位可防止TNFα诱导的H9c2细胞死亡。** A类和B类感染对照腺β-半乳糖的H9c2细胞的共焦显微照片(顶行)，腺-FLAG-Nix(*中间一排*)，或aden-FLAG-sNix(*最下面一行*).A类，H9c2细胞在典型组织培养条件下。红色=MitoTracker红色；绿色=标志；蓝色=DAPI核染色。B类24小时血清剥夺后，H9c2细胞(车辆或用TNFα（20 ng/ml）或PDGF（20 ng/ml）治疗后60分钟。红色=层粘连蛋白a/c标记核膜；绿色=标志；蓝色=DAPI核染色。C类，荧光显微照片(左边)现场展示(绿色)然后就死了(红色)载体或TNFα（50 ng/ml）处理24小时后，H9c2细胞感染对照腺-β-gal、腺-FLAG-Nix或腺-FLAG-sNix。在每种条件下，从三个独立的孔中计算死亡细胞的百分比(*正确的*).

**图3。**
**TNFα刺激后sNix和NFκB p65/RelA与细胞核的关联和共移位。** A类表达pDsRed修饰的红色荧光蛋白p65/RelA的H9c2细胞的共焦显微照片(红色)β-半乳糖对照(顶部)或FLAG-Nix(*中间的*)或FLAG-sNix(底部). FLAG表位染色绿色柱显示添加（20ng/ml）TNFα后60分钟和120分钟，红色p65/RelA和sNix的核转位，而不是Nix的核转位。添加TNFα之前，细胞液中sNix和p65/RelA的协同放大作用由*黄色荧光*时间为0。B类sNix和p65/RelA从未刺激H9c2细胞的胞浆和TNFα刺激H9c 2细胞的核质中共同免疫沉淀。外汇=分数；*IP（IP）*=免疫沉淀抗体；*IB公司*=免疫印迹抗体。微管蛋白和层粘连蛋白B分别是胞浆和核组分的负荷控制因子。C类p65/RelA缺失的MEF中没有TNFα刺激的sNix核转位。红色=层粘连蛋白a/c标记核膜；绿色=标志；蓝色=DAPI核染色。D.TNFα刺激野生型MEF中的sNix核移位。

**图4。**
**在H9c2心肌成肌细胞中sNix表达后，TNFα刺激的NFκB信号被抑制。** A类，H9c2细胞全基因组ChIP-seq信号强度的热图描述，作为与生物信息学预测的p65/RelA结合位点的接近度的函数。结果显示有和没有TNFα和sNix。*chr公司*，染色体。B类，五个遗传示例显示了不同实验条件下的个体p65/RelA ChIP-seq强度以及相应的热图图。C类，使用MEME Suite在重复标记p65/RELA结合位点发现的前两个转录因子基序（RELA和REL）。前100个p65/RelA峰（通过ChIP-seq倍变化）用于*从头开始*主题搜索。D类，总结了利用DAVID对71个TNFα调控基因进行的基因本体分析。基因本体类别按日志排序₁₀ 第页不成比例表示的值。E类，TNFα诱导的基因调节（log₂71个TNFα调节基因的折叠诱导）。一对双尾蛇t吨测试用于计算第页值。插图到*正确的*显示sNix的个体调节受到抑制(顶部)和非抑制mRNA。

**图5。**
**验证研究表明，sNix抑制TNFα诱导的p65/RelA占用，并抑制TNFβ刺激的NFκB靶基因表达。** A类，代表性的ChIP-qPCR测定TNFα和sNix对三个sNix抑制H9c2细胞表达的NFκB靶基因中p65/RelA结合强度的影响。B类中相同基因的ChIP-qPCR和RT-qPCR的组平均数据和组间比较A类数据为三种PCR反应的平均值±标准差。*Rel丰富*，相对富集。

**图6。**
**心肌细胞表达的sNix定位于细胞核和细胞质，改变心脏基因表达而不诱导细胞凋亡或心肌病。** A类、Nix和sNix转基因小鼠心脏中FLAG-Nix和-sNix心肌部分的免疫印迹分析。*S公司*=由α-微管蛋白（α*-小管*);*10便士*= 10,000 ×克富含COX IV标记线粒体蛋白的颗粒；*Nuc（数字）*=用层粘连蛋白标记的核分数。B类，代表性M型超声心动图(顶部)和荧光TUNEL染色(底部)来自控制、Nix和sNix心脏。定量组超声心动图测量见“结果”C类TUNEL标记的定量组数据(n个=每组5人）。续，控制。D类sNix调节心脏基因表达的无监督分层聚类。左侧，原始读取；*正确的*，标准化读取。每列是一个单独的鼠标心。E类，sNix调节的心脏mRNA的基因本体分析结果。

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