The L-cysteine desulfurase NFS1 is localized in the cytosol where it provides the sulfur for molybdenum cofactor biosynthesis in humans

doi:10.1371/journal.pone.0060869

.2013年4月12日；8（4）：e60869。

doi:10.1371/journal.pone.0060869。 2013年印刷。

L-半胱氨酸脱硫酶NFS1定位于细胞质中，为人类钼辅因子的生物合成提供硫

兹沃尼米尔·马雷利亚¹, 米塔·穆利克·乔杜里, 卡斯滕·多西, 卡斯滕·希尔, 奥托·鲍曼, Hans-Gerd Löhmannsröben先生, 赛尔克·莱姆库勒

附属公司

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内政部： 10.1371/journal.pone.0060869

L-半胱氨酸脱硫酶NFS1定位于细胞质中，为人类钼辅因子的生物合成提供硫

兹沃尼米尔·马雷利亚等。公共科学图书馆一号. 2013.

.2013年4月12日；8（4）：e60869。

doi:10.1371/journal.pone.0060869。 2013年印刷。

作者

兹沃尼米尔·马雷利亚¹, 米塔·穆利克·乔杜里, 卡斯滕·多西, 卡斯滕·希尔, 奥托·鲍曼, Hans-Gerd Löhmannsröben先生, 赛尔克·莱姆库勒

附属

¹德国波茨坦大学生物化学研究所分子酶学系。

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内政部： 10.1371/journal.pone.0060869

摘要

在人类中，L-半胱氨酸脱硫酶NFS1在线粒体铁硫簇生物合成以及线粒体和细胞溶质tRNA的硫修饰中起着关键作用。我们之前已经证明纯化的NFS1能够将硫转移到MOCS3的C末端结构域，MOCS3是一种参与钼辅因子生物合成和tRNA硫代化的细胞溶质蛋白。然而，到目前为止，还没有直接证据表明NFS1和MOCS3在人类细胞胞浆中的相互作用。在这里，我们使用Förster共振能量转移和分裂-EGFP系统提供直接数据来显示NFS1和MOCS3在人类细胞胞浆中的相互作用。分馏细胞的免疫检测和共焦荧光显微镜定位研究证实了NFS1和MOCS3在胞浆中的共定位。纯化的NFS1用于重建粗糙脉孢菌nit-1突变株缺乏的钼酶活性，进一步证明NFS1是真核生物Moco生物合成的硫供体。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。HeLa细胞亚细胞分离后NFS1和MOCS3的免疫检测。**
总蛋白提取物（T）、胞浆（C）、线粒体（M）和细胞核（N）分别从80-90%融合的HeLa细胞中制备，以避免隔室的交叉污染。使用以下抗体通过免疫印迹分析每个细胞组分的蛋白质：抗NFS1(*顶部面板*)，抗γ-肌动蛋白作为细胞溶质标记物控制(*第二个面板*)，抗层粘连蛋白B1作为核标记物(*第三个面板*)，抗ABCB7作为线粒体内膜标志物(*第四面板*)，抗MOCS3作为胞质标志物(*第五个面板*)和抗柠檬酸合成酶作为线粒体基质标记物(底部).

**图2。荧光显微镜观察HeLa细胞中表达的EYFP/ECFP融合蛋白。**
EYFP公司(*绿色假彩色*)和ECFP标签(*红色假彩色*)对HeLa细胞中的蛋白质进行亚细胞定位和共定位（“合并“行导致黄色发生共定位时）。此外，还可以绘制线轮廓(*正确的*)显示了EYFP和ECFP沿“合并”图中显示的箭头（距离以µm为单位）的像素强度。*A、，*NFS1-EYFP和ISD11-ECFP（线粒体定位）；B类NFS1-EYFP（细胞溶质定位）和ISD11-ECFP（核定位）；C类、EYFP-NFS1Δ1-55和ISD11-ECFP；D类,E类NFS1-EYFP和ECFP-MOCS3；F类、EYFP-NFS1Δ1-55和ECFP-MOCS3。以下数字*面板E*是一个*特写镜头*图中所示区域（框）的图形*面板D*.标尺，20µm（除*E、，*为2µm）。

**图3。荧光显微镜观察HeLa细胞中表达的EYFP/ECFP融合蛋白。**
EYFP公司(*绿色假彩色*)和ECFP标签(*红色假彩色*)对HeLa细胞中的蛋白质进行亚细胞定位和共定位分析（“合并“行导致黄色发生共定位时）。此外，还可以绘制线轮廓(*正确的*)显示了EYFP和ECFP沿“合并”图中显示的箭头（距离以µm为单位）的像素强度。*A、，*EYFP-MOCS2A和ECFP-MOCS3；B类、EYFP-MOCS2A和NFS1-ECFP；C类、EYFP-MOCS2A和ECFP-NFS1Δ1-55；D类、EYFP和ECFP。比例尺，20µm。

**图4。利用分裂-EGFP系统分析HeLa细胞中NFS1和MOCS3的相互作用。**
用共焦荧光显微镜分析了HeLa细胞中不同裂解EGFP融合蛋白的亚细胞EGFP组装。在共转染（EGFP的组装）后，表达了以下融合蛋白^1–157和EGFP^158–238导致了*绿色伪彩色*):A类，ISD11-EGFP^1–157和NFS1-EGFP^158–238;B类，MOCS3-EGFP^1–157和NFS1-EGFP^158–238;C类，MOCS3-EGFP^1–157和NFS1Δ1-55-EGFP^158–238;D类，MOCS3-EGFP^1–157和MOCS3-EGFP^158–238;E类、NFS1-EGFP^1–157和NFS1-EGFP^158–238;F类，ISD11-EGFP^1–157和NFS1Δ1-55-EGFP^158–238用MitoTracker®DeepRed观察HeLa细胞的线粒体(红色)或DAPI染色显示细胞核(洋红). 合并的图片显示在右侧（要么导致*黄色的*或白色). 标尺，20µm；插图中的比例尺，2µm。

**图5。ECFP供体荧光寿命的量化（τ₁)通过HeLa细胞中的时间分辨FRET。**
在HeLa细胞中表达ECFP和EYFP标记蛋白后，通过FRET测量确定ECFP供体寿命，并显示双指数衰减ECFP的长寿命成分。A类，ECFP供体对照，显示ECFP-EYFP融合蛋白，ECFP和EYFP，以及ECFP-MOCS3和EYFP-MOCS2A的表达。B类MOCS3-MoeBD-ECFP、ECFP-MOCS3-RLD、ECFP-MOCS3和ECFP-MOCS3/EYFP的ECFP供体寿命。C类显示了在EYFP-NFS1Δ1-55存在下MOCS3-MoeBD-ECFP、ECFP-MOCS3-RLD和ECFP-MOCS3融合的ECFP供体寿命。对于每个值N = 测量30–42个细胞（显示为平均值±标准偏差）。

**图6。硝酸还原酶活性的重建*N.crassa nit-1号机组*使用不同硫供体的提取物。**
所有重组混合物均含有30µl新制备的混合物*N.crassa nit-1号机组*提取物，10µl 0.5 M钼酸钠和10µM MOCS3和/或NFS1Δ1-55，或过量的分离Moco和10μM活性物质*大肠杆菌*MPT合成酶（阳性对照）。添加1 mM L-半胱氨酸或1 mM硫代硫酸钠作为硫源。将反应混合物在室温下孵育30 min，然后再孵育20 min以进行重组硝酸还原酶的反应，最后停止反应并在540 nm处测定生成的亚硝酸盐。*未注明日期*.，无法检测。

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1. Mihara H，Kurihara T，Yoshimura T，Soda K，Esaki N（1997）半胱氨酸亚硫酸酯脱硫酶，一种具有硒代半胱氨酸裂解酶和半胱氨酸脱硫酶活性的大肠杆菌NIFS样蛋白。新型吡哆醛酶的基因克隆、纯化和表征。生物化学杂志272:22417–22424。-公共医学
1. Flint DH（1996）大肠杆菌含有一种蛋白质，该蛋白质在功能和N末端序列上与棕色固氮菌nifS基因编码的蛋白质同源，并且可以参与二羟酸脱水酶Fe-S簇的合成。生物化学杂志271:16068–16074。-公共医学
1. Nakai Y、Yoshihara Y、Hayashi H、Kagamiyama H（1998）小鼠nifS样蛋白的cDNA克隆和表征，m-Nfs1：真核生物nifS样蛋白质的线粒体定位。FEBS信件433:143–148。-公共医学
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这项工作得到了德国沃尔克斯研究所（Studienstiftung des deutschen Volkes）和DFG拨款LE1171/5-3（给S.L.）的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

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[1] Zheng L，White RH，Cash VL，Jack RF，Dean DR（1993）半胱氨酸脱硫酶活性表明NIFS在金属簇生物合成中的作用。美国国家科学院院刊90:2754–2758。-项目管理委员会-公共医学

[2] Zheng L，White RH，Cash VL，Jack RF，Dean DR（1993）半胱氨酸脱硫酶活性表明NIFS在金属簇生物合成中的作用。美国国家科学院院刊90:2754–2758。-项目管理委员会-公共医学

[3] Mihara H，Kurihara T，Yoshimura T，Soda K，Esaki N（1997）半胱氨酸亚硫酸酯脱硫酶，一种具有硒代半胱氨酸裂解酶和半胱氨酸脱硫酶活性的大肠杆菌NIFS样蛋白。新型吡哆醛酶的基因克隆、纯化和表征。生物化学杂志272:22417–22424。-公共医学

[4] Mihara H，Kurihara T，Yoshimura T，Soda K，Esaki N（1997）半胱氨酸亚硫酸酯脱硫酶，一种具有硒代半胱氨酸裂解酶和半胱氨酸脱硫酶活性的大肠杆菌NIFS样蛋白。新型吡哆醛酶的基因克隆、纯化和表征。生物化学杂志272:22417–22424。-公共医学

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[6] Flint DH（1996）大肠杆菌含有一种蛋白质，该蛋白质在功能和N末端序列上与棕色固氮菌nifS基因编码的蛋白质同源，并且可以参与二羟酸脱水酶Fe-S簇的合成。生物化学杂志271:16068–16074。-公共医学

[7] Nakai Y、Yoshihara Y、Hayashi H、Kagamiyama H（1998）小鼠nifS样蛋白的cDNA克隆和表征，m-Nfs1：真核生物nifS样蛋白质的线粒体定位。FEBS信件433:143–148。-公共医学

[8] Nakai Y、Yoshihara Y、Hayashi H、Kagamiyama H（1998）小鼠nifS样蛋白的cDNA克隆和表征，m-Nfs1：真核生物nifS样蛋白质的线粒体定位。FEBS信件433:143–148。-公共医学

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[10] Land T，Rouault TA（1998）通过交替使用AUG调节人铁硫簇组装酶Nifs对不同亚细胞隔室的靶向性。分子电池2:807–815。-公共医学

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