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.2013年7月:60:97-106。
doi:10.1016/j.yjmcc.2013.04.004。 Epub 2013年4月13日。

利用钙活性作为成功的功能指标优化成纤维细胞对心肌细胞的直接重编程

附属公司

利用钙活性作为成功的功能指标优化成纤维细胞对心肌细胞的直接重编程

罗素C亚的斯亚贝巴等。 J Mol Cell心脏病学. 2013年7月.

摘要

成纤维细胞直接转化为诱导心肌细胞(iCMs)在再生医学方面具有巨大潜力。最近的出版物报道了重大进展,但重新编程的评估依赖于非功能性测量,如心肌细胞标记物的流式细胞术或由心肌细胞特异性启动子驱动的GFP表达。这个问题是实用性的:在重编程实验中筛选的大量细胞中,最严格的措施——检测细胞兴奋和自发收缩肌细胞存在的电生理学——并不容易量化。然而,兴奋和收缩由心肌细胞的第三个功能特征联系在一起:细胞内钙水平的节律振荡。我们开始优化成纤维细胞向iCMs的直接转化,并使用可量化的钙报告物快速评估功能性转分化。我们构建了一个报告系统,其中钙指示剂GCaMP由心肌细胞特异性肌钙蛋白T启动子驱动。使用钙活性作为我们的主要结果测量,我们比较了几种已发表的转录因子组合以及小鼠胚胎成纤维细胞中的新组合。最有效的组合包括Hand2、Nkx2.5、Gata4、Mef2c和Tbx5(HNGMT)。这种组合的效率是单用GMT的50倍以上,产生具有心肌细胞标记物表达、强健的钙振荡和自发搏动的iCM,在重编程因子失活后持续数周。对于成年小鼠心脏成纤维细胞向iCM的转分化,HNGMT也比先前发表的因子组合显著更有效。钙功能定量是鉴定和评价直接重编程产生的心肌细胞的一种方便有效的手段。使用这一严格的结果衡量标准,我们得出结论,HNGMT产生iCM的效率高于先前公布的方法。

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数字

图1
图1。TroponinT-GCaMP5钙报告
A) 肌钙蛋白T(TNNT2公司)基因启动子驱动基因编码的钙指示剂GCaMP5和促癌素抗性盒的表达。GCaMP蛋白由Ca2+-敏感的钙调素结构域与GFP融合。当细胞内钙2+低,钙调素结构域阻止GFP的正确折叠,导致GFP荧光水平低。当细胞内钙2+较高时,钙调素结构域移动,允许GFP折叠和明亮的荧光。B) 肌钙蛋白T-GCaMP5报告子在胚胎心肌细胞中的验证。从14.5 dpc的小鼠胚胎中分离出心室心肌细胞,并用报告慢病毒转导。转导后48小时记录GCaMP活性。左侧面板对应于补充电影S1的单个帧。白色箭头表示检测振荡荧光的区域,如右侧面板所示。RFU,使用ImageJ软件中的“强度v时间监视器”计算的相对荧光单位。
图2
图2。直接成纤维细胞重编程诱导心肌细胞的功能定量
A) 诱导心肌细胞(iCMs)的直接成纤维细胞重编程示意图。B) 诱导后14天,在击败iCM中的GCaMP活性。左侧面板对应于补充电影S4的单个帧,其中显示Ca2+HNGMT处理产生的自发搏动iCM中的通量,覆盖红色荧光图像以显示用于量化总细胞的PGK-H2B-mCherry载体。右侧面板追踪GCaMP荧光的振荡,对应于细胞内Ca的振荡2+,位于白色箭头标记的区域。比例尺50μm。RFU,使用ImageJ软件中的“强度v时间监视器”计算的相对荧光单位。C) 使用GCaMP活性对功能性ICM进行量化。根据诱导后14天拍摄的10s电影中的GCaMP反复振荡,确定功能性iCM。活动表示为在10秒电影中显示重复GCaMP振荡的细胞的百分比除以每个场的细胞总数。数据以平均值±SEM表示。*表示与GMT相比p<0.05。
图3
图3。第14天iCM的免疫细胞化学分析
心肌细胞标记物心脏肌钙蛋白T(cTnT)、α-肌球蛋白重链(α-MHC)和肌球蛋白α-肌动蛋白在HNGMT-iCM中表达。白色方框中的区域在插图中放大,以显示肌节结构。通过平滑肌肌球蛋白重链(smMHC,Myh11)染色检测推测的平滑肌细胞。DAPI染色(蓝色)标记细胞核。标尺50μm。
图4
图4。重组iCM表型的稳定性
A) 在诱导后14、21和28天对GCaMP活性进行量化,并将HNGMT处理的细胞与诱导后5、10或15天连续施用或停用的强力霉素进行比较。数据以平均值±SEM表示。除第5天去除Dox外,在第28天可以检测到所有情况下的跳动、GCaMP+iCM。B) 诱导后28天,对代表性HNGMT-iCMs中的肉质α-肌动蛋白(红色)进行免疫染色。DAPI染色(蓝色)标记细胞核。标尺50μm。C) 诱导后第36天记录GCaMP活性,第15天去除强力霉素(因此3周内没有外源性转录因子诱导)。右侧面板显示GCaMP荧光在左白色箭头所示区域的振荡。左侧面板是补充电影S6的单帧,显示GCaMP活性和强劲的细胞收缩。比例尺50μm。
图5
图5。iCM基因表达分析和兴奋-压缩耦合组分评估
A) 热图显示微阵列分析中选定基因的表达数据。在诱导后第21天对从假定的iCM收集的RNA进行微阵列。表达标准化为未经处理的MEF,红色表示阳性折叠变化,绿色表示阴性折叠变化。B) 兴奋-收缩系统的关键组成部分:动作电位激发引起内向Ca2+通过钙进入心肌细胞的电流V(V)1.2通道。Ca的流入2+离子刺激Ryanodine受体(RyR)释放额外的钙2+从肌浆网(SR)的钙螯合蛋白储存区进入胞浆,引起肌钙蛋白C和肌钙蛋白原肌球蛋白复合物的激活,调节收缩。细胞质钙2+然后,通过包括Na在内的多种机制的组合,水平迅速降低+/钙2+通过NCX交换并通过Phospholamban(PLN)调节的肌内质网钙ATP酶(SERCA)泵入SR。嗜连接蛋白有助于将SR连接到肌膜。图表是由施维雅医学艺术公司经许可制作的。C) iCM中兴奋抑制基因的表达。通过微阵列分析获得的基因表达数据通过定量RT-PCR进行确认,并归一化为胚胎心肌细胞(E14.5)中的表达水平。钙螯合素V(V)HGMT和HNGMT产生的iCM中,磷蛋白聚糖的表达最高,这两种因子组合产生的GCaMP+细胞最多。数据以平均值±SEM表示。*表示与GMT相比表达增加p<0.05。
图6
图6。成人心脏成纤维细胞来源的iCM
A) 使用GCaMP活性对功能性心脏成纤维细胞衍生的iCM进行定量。根据诱导后14天拍摄的10s电影中的GCaMP反复振荡,确定功能性iCM。活动表示为在10秒电影中显示重复GCaMP振荡的细胞的百分比除以每个场的细胞总数。数据以平均值±SEM表示。*表示与GMT相比p<0.05。#表示与HGMT相比p<0.05。B) 诱导后第14天,在典型的心脏成纤维细胞衍生iCM中记录到GCaMP活性。顶部面板是补充电影S7的单帧,显示GCaMP活动和自发收缩。下部面板显示GCaMP荧光在上面白色箭头指示的区域出现振荡。比例尺50μm。C) 诱导14天后心脏成纤维细胞衍生iCM的免疫细胞化学分析。心肌细胞标记物心脏肌钙蛋白T(cTnT)、α-肌球蛋白重链(α-MHC)和肌球蛋白α-肌动蛋白在HNGMT-iCM中表达。白色方框中的区域在插图中放大,以显示肌节结构。通过平滑肌肌球蛋白重链(smMHC,Myh11)染色检测推测的平滑肌细胞。DAPI染色(蓝色)标记细胞核。标尺50μm。

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引用人

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    1. Ieda M、Fu JD、Delgado-Olguin P、Vedantham V、Hayashi Y、Bruneau BG等。通过特定因子将成纤维细胞直接重编程为功能性心肌细胞。单元格。2010;142:375–86.-项目管理咨询公司-公共医学
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