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.2013年6月；87(11):6469-81.
doi:10.1128/JVI.03456-12。 Epub 2013年4月3日。

蜱传脑炎病毒复制位点的三维结构和复制RNA的贩运

丽莎·米奥林 1, 伊内斯·罗梅罗·布雷, 保罗·马乌里, 西蒙·霍普, Jacomine Krijnse-Locker公司, 拉尔夫·巴滕施拉格, 亚历山德罗·马尔切洛
附属公司

蜱传脑炎病毒复制位点的三维结构和复制RNA的贩运

丽莎·米奥林等。 J维罗尔. 2013年6月.

摘要

黄病毒复制伴随着细胞膜的重排，这可能促进病毒基因组复制并保护病毒成分免受宿主细胞反应的影响。病毒复制位点的拓扑结构和复制病毒RNA的命运尚不完全清楚。我们利用电子显微镜绘制了感染细胞和转染复制子的细胞中蜱传脑炎病毒（TBEV）复制区的组织结构。在这两种条件下，在感染细胞中也含有病毒的内质网（ER）的管腔内可以看到80nm的小泡。通过电子断层扫描，这些小泡表现为内质网膜的内陷，显示出一个孔，可以将新合成的病毒RNA释放到细胞质中。为了追踪TBEV RNA的去向，我们利用了我们最近开发的病毒RNA荧光标记方法，用于活细胞成像并结合漂白技术。TBEV RNA发现于病毒诱导的小泡外，小泡与内质网膜相关，或在并列内质网池的特定区域内自由移动。根据我们的结果，我们提出了黄病毒复制室可能的拓扑结构的生物学相关模型，该复制室由复制囊泡和保留复制病毒RNA的受限囊外空间组成。因此，TBEV修改了内质网膜结构，为病毒复制提供了一个受保护的环境，并为病毒生命周期的后续步骤提供了新复制RNA的维持环境。

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图1
图1
TBEV蛋白和dsRNA在BHK-21感染细胞中的定位。BHK-21细胞要么模拟感染（mock；右），要么在MOI为2时感染TBEV（TBEV；左）。24小时后，按照材料和方法中的描述固定细胞并进行免疫荧光处理。（A） 与抗TBEV抗血清（TBEV；Alexa-Fluor 594，红色）和单克隆抗NS1抗体（NS1；Alexa-Fluor 488，绿色）共染色的细胞；（B） 与抗TBEV抗血清（TBEV；Alexa-Fluro 594，红色）和J2单克隆抗dsRNA抗体（dsRNA；Alexa Fluor 488，绿色）共染色的细胞；（C） 与抗prM抗血清（prM；Alexa-Fluor 594，红色）和单克隆抗NS1抗体（NS1；Alexa Fluor 488，绿色）共染色的细胞；（D） 细胞与抗TBEV抗血清（TBEV；Alexa-Fluro 594，红色）和抗PDI单克隆抗体（PDI；Alexa-Fluor 488，绿色）共染色。中间面板中显示的缩放图像对应于左侧面板中的方框区域。
图2
图2
TBEV感染引起的细胞膜改变的超微结构分析。（A） 如材料和方法中所述，用MOI为2的TBEV感染BHK-21细胞，固定24hpi，并进行ET处理。左，双轴断层扫描的断层切片，如补充资料中的电影S2所示。感染后，在粗略内质网腔中观察到小泡（Ve）和病毒（黄色箭头）。右，对整个层析图像进行三维表面重建，显示内质网腔内TBEV诱导的小泡（浅黄色）（浅棕色）以及病毒（深红色）。（B） 通过整个层析图的两个层析切片示例（左侧和右侧），描绘了内质网小管之间的连接（黄色箭头）。（C） 左，同一双轴断层扫描的断层切片，描绘了内质网管腔中靠近新组装病毒（黄色箭头）的几个小泡，也在高尔基体中观察到（见电影S1）；右图，同一区域的3D表面渲染显示了与TBE病毒共享内质网腔的TBEV相关小泡（浅黄色），并被内质网膜包围（浅棕色）。（D） 左侧，连续的单片，描绘了几个TBEV诱导的小泡向胞浆的开口（绿色、黄色和蓝色箭头）；右，整个断层图像的3D重建的XZ视图，显示这些朝向胞质溶胶的开口（具有匹配颜色的箭头）。（E） 左侧，断层扫描显示TBEV诱导的小泡与其相邻小泡紧密接触（黄色箭头）；右，三维重建显示这些囊泡之间的接触。注意，在这些断层图中没有观察到连接小泡的开口。
图3
图3
TBEV感染细胞的免疫金EM。BHK-21细胞在MOI为2和固定24 hpi时感染TBEV，解冻冰冻切片用PDI（A）、NS1（B和C）和prM（E和F）抗体以及主要识别结构蛋白E和非结构蛋白NS1的抗TBEV血清（D）标记。扩张内质网池（A）管腔内的小泡被特异性标记为抗NS1（B和C）和抗TBEV抗体（D）。所有面板中的箭头突出显示了内质网腔中的TBEV病毒，特别是标记有prM（E和F）和TBEV（D）抗体的病毒，或是向高尔基体输送的病毒。缩写：M，线粒体；N、 细胞核；内质网；Ve，囊泡；Vi，病毒。
图4
图4
pTNd/ΔME_24×MS2诱导细胞膜改变的超微结构分析。（A） 用TNd/ΔME_24×MS2复制子RNA电穿孔BHK21-EYFP-MS2nls细胞。电穿孔后20小时（hpe），固定细胞，用Triton X-100渗透，并与抗dsRNA抗体孵育，然后用与Alexa-594结合的二级抗体显示。EYFP通道显示在左侧面板中，dsRNA显示在中间面板中，merge显示在右侧面板中。（B） 用TNd/ΔME_24xMS2_GAA复制子RNA电穿孔BHK21-EYFP-MS2nls细胞，并按照面板A所述进行处理。左，显示内质网腔中TBEV诱导的小泡（Ve）的双轴断层片；右，完整断层图的三维重建。ER膜呈浅棕色，TBEV诱导的小泡呈浅黄色。补充资料中的电影S4中显示了该断层图及其3D膜渲染。（D） 左，通过同一断层图显示相邻内质网小管之间连接的连续单层切片；右，对整个断层图进行3D重建，显示内质网小管相互连接的网络。请注意，与感染细胞相比，这些细胞中的ER高度碎片化。（E） 左，通过同一断层图的连续单层切片显示TBEV诱导的囊泡朝胞浆的开口（黄色箭头）；右图，3D表面模型显示了连接囊泡内部和胞浆的开口。
图5
图5
复制素诱导的膜改变的免疫金EM。BHK21-EYFP-MS2nls细胞用TNd/ΔME_24×MS2电穿孔，24 h后固定，解冻冰冻切片用PDI（A）和NS1（B）抗体以及抗TBEV血清（C和D）标记。所有图像均显示TBEV诱导的囊泡（Ve），这些囊泡特异性标记有抗NS1（B）和抗TBEV（C和D）抗体。（D） 图中显示了复制子转染引起的膜改变的高倍图像，对应于C组中的盒状区域。用抗TBEV抗体标记的囊泡（Ve）和卷曲膜（CM）。
图6
图6
TBEV复制的RNA不能在细胞质中自由扩散。（A） 通过FRAP时间进程分析TBEV RNA动态。用TNd/ΔME_24×MS2复制子RNA和表达EYFP-MS2的载体对BHK-21细胞进行电穿孔。在电穿孔后的指定时间点，分析漂白区EYFP-MS2蛋白的荧光回收率。该图显示了归一化为预漂白值的荧光强度值，并针对成像过程中的荧光损失进行了校正（34、36、55）。数据表示至少10个细胞采集的平均值±标准偏差。（B） 电穿孔后14小时（29.25×29.25μm）在BHK-21细胞中进行的FRAP实验的图像序列。明亮的核周区域代表亚细胞隔室，复制的病毒RNA聚集在该隔室中，ROI被吸引到该隔室。在漂白前（预漂白，0秒）、漂白后立即（漂白，20秒）和漂白后400秒（漂白后）收集时间。还提供了一部电影作为支持信息（请参阅补充资料中的电影S5）。（C） 复制室中GFP流动性分析。用表达CherryMS2nls的载体对BHK-21细胞进行电穿孔，以标记RC，并用GFP表达质粒（pEGFP-N1），在TBEV复制子RNA存在（红线，GFP和TNd/ΔME_24×MS2）和不存在（绿线，GFP）的情况下进行电穿孔。24 h后，用FRAP研究GFP动力学。在图中，比较了GFP蛋白在两种不同实验条件下的回收曲线。将荧光强度值归一化为预漂白值，并针对成像程序导致的荧光损失进行校正，如前所述。数据表示10个单元格的采集平均值±标准偏差。（D） 在存在TBEV复制RNA的情况下，转染GFP和CherryMS2nls的BHK-21细胞的代表性图像。显示了间隔0.5μm的41个图像的z投影。（E） 面板C中描述的FRAP实验的图像序列（36.56 x 7.14μm）。顶部，两个通道中的预漂白堆叠（0秒）。圆圈表示在以CherryMS2nls标记的RC中选择的漂白剂区域。中间，漂白事件后立即的时间点（0.5秒）；底部，漂白后堆叠（13秒）。视频也可作为支持信息提供（请参阅补充资料中的电影S6）。（F） 用TNd/ΔME_24×MS2复制子RNA和表达EYFP-MS2的载体对BHK-21细胞进行电穿孔。24小时后，FLIP监测RC中病毒RNA的释放。（G） 显示了FLIP实验中的选定图像（36.56 x 36.56μm）。在远离簇状TBEV RNA的细胞质中选择漂白区域（底部的红色圆圈）。然后测量RC内（蓝色圆圈，ROI_1）和外（绿色圆圈，RI_2）细胞质中的荧光损失。在上图中，比较了三种不同ROI（漂白剂、ROI_1和ROI_2）的荧光强度损失。数据按照面板A所述进行标准化，并表示10个单元的采集平均值±标准偏差。视频也可作为支持信息（请参阅补充资料中的Movie S7）。
图7
图7
TBEV复制隔间组织在离散集群中。（A） 用TNd/ΔME_24×MS2复制子RNA和EYFP-MS2nls报告子对BHK-21细胞进行电穿孔。转染24小时后，用FLIP分析RC内的病毒RNA贩运。为此，如下图所示（29.25 x 29.25μm），漂白区域（红色圆圈）位于隔间内。然后在两个不同的区域测量荧光损失，一个区域围绕漂白区域（蓝色区域；ROI_1），另一个区域更远（绿色圆圈；ROI_2）。顶部面板比较了三个选定ROI的荧光曲线损失。如前所述，将数据归一化，并表示从10个单元采集的平均值±标准偏差。视频也可用作支持信息（请参阅补充资料中的电影S8）。（B） BHK21-EYFP-MS2nls细胞用TNd/ΔME_24×MS2电穿孔，24 h后固定，解冻冰冻切片用GFP抗体标记免疫金。不同情况的选定示例显示在面板C和D中。（E）如图7B所示制备的GFP标记EM冷冻切片的量化。计数一式三份，测量每个网格中>100个金颗粒的分布。数据以百分比±SD绘制。
图8
图8
TBEV诱导的膜改变模型。左图为图4B所示的双轴断层扫描切片；右侧，TBEV复制室可能组织的二维示意图模型。TBEV复制导致在细胞的核周区形成一个高度组织化的内质网，内质网由相互连接的并列内质网膜组成。该隔室由小泡（Ve；浅黄色）、扩张的内质网池（棕色）和胞质泡外间隙（浅蓝色）组成，小泡通过孔状通道与细胞质相连。子代病毒RNA在内质网内陷的管腔内合成，然后通过孔被挤压到胞质泡外空间。一旦释放到这个区域，病毒RNA就可以在下游组装成新的病毒颗粒，这些病毒颗粒会发芽回到受感染细胞的内质网池腔中（图2）。或者，这些RNA可能参与进一步的翻译和复制。
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