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.2013年6月；280(11):2665-74.
doi:10.1111/febs.12264。 Epub 2013年5月7日。

蛋白酶体抑制剂MG-132诱导MCPIP1表达

卢卡斯·斯卡尔尼亚克 1, 亚历山大·科伊, 朱兰塔·朱拉
附属公司
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蛋白酶体抑制剂MG-132诱导MCPIP1表达

卢卡斯·斯卡尼亚克等。 2月J日. 2013年6月.
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摘要

蛋白酶体是一种蛋白质复合体，负责降解多泛素标记的蛋白质。除了去除靶蛋白外，蛋白酶体还以蛋白水解和非蛋白水解的方式参与基因转录的调控。本研究检测蛋白酶体抑制对单核细胞趋化蛋白-1诱导蛋白1（MCPIP1）基础表达的影响。蛋白酶体抑制剂MG-132处理HepG2或HeLa细胞后，MCPIP1在mRNA和蛋白质水平上的表达显著增加。有趣的是，MG-132并没有改变MCPIP1的稳定性。相反，观察到的蛋白增加被放线菌素D阻断，表明MG-132治疗后MCPIP1蛋白的增加与从头mRNA合成有关。使用几种抑制剂，我们确定了细胞外信号调节激酶1/2和p38激酶参与MG-132上调MCPIP1。我们的发现首次显示蛋白酶体抑制通过调节细胞内信号通路的活性对MCPIP1蛋白表达的影响。MCPIP1-myc蛋白的过度表达降低了HeLa细胞的生存能力，但不降低HepG2细胞的存活能力，这与HeLa电池对MG-132毒性的敏感性增加有关。值得注意的是，MG-132治疗和MCPIP1-myc过度表达都导致了细胞凋亡的激活，正如两种细胞系中caspase 3/7的诱导所揭示的那样。这表明MCPIP1上调蛋白酶体抑制的毒性特性，这是公认的几种癌症治疗方法。

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数字

图1
图1
蛋白酶体抑制剂MG-132增加MCPIP1的表达。（A） ，（B）用1μ米MG-132或DMSO用于指定的时间段。用MCPIP1和α-微管蛋白特异性抗体对蛋白质提取物进行蛋白质印迹。（C） HepG2细胞用1μ米MG-132或DMSO用于指定的时间段。分离总RNA并进行实时PCR。MCPIP1转录水平标准化为EF2转录。该图显示了三个独立实验的平均值±SE，表示为每个时间点的折叠变化与DMSO处理的对照。对于统计数据t吨-执行测试：*P（P）< 0.05,***P（P）<0.001与对照组。（D） HepG2细胞用1μ米MG-132或DMSO刺激1小时，用10 ng·mL刺激5分钟−1IL-1β。蛋白质提取物用IκBα-和α-微管蛋白特异性抗体进行免疫印迹（SE，短期暴露；LE，长期暴露）。斑点A、B和D是三个独立实验的代表。
图2
图2
MG-132上调MCPIP1需要蛋白质和mRNA从头开始合成。（A） 用5μg·mL预处理HepG2细胞−1放线菌酮（CHX）30分钟，然后用1μ米MG-132或DMSO用于指定的时间段。未经处理的细胞作为对照。蛋白质提取物用MCPIP1-和α-微管蛋白特异性抗体进行western印迹。（B） （A）中的印迹定量表示为相对于未处理细胞的光密度。（C） 用环己酰亚胺（CHX）或二甲基亚砜预处理HepG2细胞30分钟，并用10 ng·mL刺激−1IL-1β作用5分钟或1小时。用IκBα和α-微管蛋白特异性抗体对蛋白提取物进行免疫印迹。（D） 用5μg·mL预处理（E）HepG2细胞−1放线菌素D 1小时，然后用1μ米MG-132用于RNA收集（D）3小时或用于蛋白质分析（E）6小时。MCPIP1转录本归一化为EF2转录本。图D显示了三个独立实验的平均值±SE，表示为折叠变化与控制。斑点A、C和E是三个独立实验的代表。
图3
图3
MG-132触发的MCPIP1中信号通路的参与增加。（A） HepG2细胞用1μ米MG-132在指定的时间段内或使用10 ng·mL−1用所示抗体对细胞裂解液进行免疫印迹。显示了三个独立实验的代表性斑点。（B） HepG2细胞用10μ米U0126，10μ米SB203580，10μ米SP600125或20μ米Bay11-7082 30分钟，用1μ米MG-132或DMSO再维持6 h。用MCPIP1-和α-微管蛋白特异性抗体对蛋白质提取物进行免疫印迹。该图表示斑点的密度定量，并显示三个独立实验的平均值±SE。对于统计数据t吨-进行了测试：*P（P）< 0.05, **P（P）与对照细胞（DMSO预处理和MG-132处理）相比，<0.01。（C） 用5、10或20μ米U0126、5、10或20μ米最终浓度为10μ的SB203580或两种抑制剂米每个，用1μ米MG-132或DMSO再维持6 h。用MCPIP1-和α-微管蛋白特异性抗体对蛋白质提取物进行免疫印迹。该图表示斑点的密度定量，并显示三个独立实验的平均值±SE。对于统计数据，采用了Tukey HSD检验后的单向方差分析：*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，与车道2中的对照细胞相比（用DMSO预处理和用MG-132处理）；##P（P）与用10μ米SB203580，使用MG-132进行处理，车道7。
图4
图4
MG-132和MCPIP1对HeLa和HepG2细胞的毒性。（A） 用不同浓度的MG-132处理HepG2和HeLa细胞24 h。为了测定细胞活力，进行MTT试验（A），并测量caspase 3和7的凋亡诱导活性（B）。图表显示了三个独立实验的平均值±SE，每个实验分为五个重复（MTT）或重复（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性），以对照组的百分比（a）或与对照组的倍数变化（B）表示。（C） ，（D）用于caspase 3和7活性测量的蛋白质提取物中MCPIP1诱导的Western blotting验证（B）。印迹具有三个独立实验的代表性。（E） 用MCPIP1转染（F）HepG2和HeLa细胞-myc公司编码或空向量。转染后两天进行MTT试验（E）和caspase 3和7活性试验（F）。图表显示了四个独立实验的平均值±SE，每个实验分为五个重复（MTT）或重复（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性），以对照组的百分比（E）或与对照组的倍数变化（F）表示。MCPIP1过度表达-myc公司在HepG2和HeLa细胞中，通过蛋白质印迹（G）进行验证。
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