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.2013年4月;138(3):741-52.
doi:10.1007/s10549-013-2498-x。 Epub 2013年3月29日。

EZH2抑制降低p38信号传导并抑制乳腺癌运动和转移

附属公司

EZH2抑制降低p38信号传导并抑制乳腺癌的运动和转移

希瑟·M·摩尔等。 乳腺癌研究治疗. 2013年4月.

摘要

EZH2是一种多梳组蛋白,在乳腺癌中发挥致癌功能,其过度表达与转移性疾病有关。据报道,EZH2通过组蛋白H3在赖氨酸27处的三甲基化作用于转录阻遏物,但它可能表现出上下文相关的激活功能。尽管EZH2与乳腺癌的不良预后和转移相关,但其在体内乳腺癌转移中的作用尚未被证实。此外,EZH2是否调节癌细胞表型和运动性尚不清楚。在这项研究中,我们发现EZH2的敲除诱导了乳腺癌细胞系中从间充质细胞到上皮细胞的表型重编程,降低了运动能力,并阻止了侵袭。在体内,MDA-MB-231细胞中EZH2下调可减少肺部自发转移。我们发现EZH2在诱导p38有丝分裂原活化蛋白激酶信号通路中发挥了意想不到的作用,p38是乳腺癌侵袭和转移的重要调节因子。在乳腺癌细胞中,EZH2与磷酸化p38(p-p38)结合,并与Polycomb抑制复合物2、EED和SUZ12的其他核心成员结合,EZH2过度表达导致p-p38和激活的下游通路蛋白水平增加。体内证实了对p-p38的影响,这与自发转移减少有关。在匹配的原发性乳腺癌和浸润性乳腺癌的临床标本中,我们发现EZH2的表达在100%的转移瘤中上调,而在63%的病例中EZH2-和p-p38同时表达,这与功能结果一致。我们的研究结果揭示了EZH2在乳腺癌中发挥作用的新机制,并为EZH2抑制减少体内乳腺癌转移提供了直接证据。

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数字

图1
图1。EZH2敲除诱导MET并减少乳腺癌细胞的侵袭
(a)SUM149和MDA-MB-231乳腺癌细胞的免疫印迹显示,EZH2蛋白与EZH2-靶向shRNA[shEZH2]的下调导致了一个蛋白表达谱,与干扰对照shRNA[Cr]相比,该蛋白表达谱表明上皮分化。E-钙粘蛋白和细胞角蛋白-18[CK-18]代表上皮标记蛋白,而波形蛋白和蜗牛1代表间充质标记蛋白。(b)典型的相位对比图像显示,与对照组相比,SUM149和MDA-MB-231细胞中的EZH2敲除(KD)导致了从间质样细胞到上皮细胞的形态学变化[放大200倍]。(c)与使用重组Boyden基底膜侵袭室试验的对照组相比,EZH2 KD减少SUM149和MDA-MB-231细胞的侵袭。左图显示了整个入侵和污损房间的代表性图像;右,通过使用ImageJ量化染色图像像素,计算平均侵犯面积±SD。[学生t检验,*p<0.0002,**p=0.03]
图2
图2。EZH2基因敲除降低乳腺癌细胞运动能力
(a和b)左侧,显示MTrackJ单个MDA-MB-231细胞轨迹、彩色点和连接线的代表性图像,来自24小时延时视频(a)加扰shRNA控制和shEZH2或(b)未经处理和DZNeP处理的细胞[放大200倍]。每个点代表10分钟的时间跨度,与宽间隔点相比,近间隔点表示在经过的时间内移动较少。右,条形图显示EZH2 KD细胞明显慢于对照组,如平均细胞速度±SEM所示[Student的t检验,*p<1×10−5,n≥25个细胞/条件]。(c)使用myc标记的EZH2-编码腺病毒暂时拯救MDA-MB-231 EZH2 KD细胞中的EZH2表达,可逆转EZH2-KD细胞运动性下降。显示感染对照或EZH2腺病毒的shEZH2细胞的细胞轨迹的代表性图像[放大200倍]。条形图显示,经EZH2腺病毒拯救后的shEZ82细胞明显快于对照腺病毒感染细胞,如平均细胞速度±SEM所示[学生t检验,*p<9×10−10,n≥90个细胞/条件]。
图3
图3。EZH2调节p38 MAPK信号通路的激活并与磷酸化p38(p-p38)结合
(a)SUM149和MDA-MB-231乳腺癌细胞的免疫印迹显示EZH2蛋白下调,EZH2-靶向shRNA[shEZH2]降低了p-p38的水平,其活性通过下游信号靶点MK2和HSP27的磷酸化来证明,与扰乱的shRNA控制细胞[Scr]相比。(b)免疫印迹显示,两种不同浓度的SB202190或SB203580在48小时内抑制MDA-MB-231细胞的p-p38活性,不会影响EZH2、SUZ12、EED或H3K27me3的水平。(c)与打乱的shRNA对照细胞相比,SUM149 shEZH2细胞中所有四种p38亚型的活化磷酸化水平降低,但不降低总亚型蛋白水平。从全细胞提取物中免疫沉淀总p-p38,然后对四种不同亚型进行Western blot分析。(d)SUM149 shEZH2全细胞提取物和打乱shRNA对照细胞的共免疫沉淀表明内源性EZH2-免疫沉淀与内源性p-p38。提取物用EZH2、p-p38或对照IgG进行免疫沉淀,并通过EZH2和p-p38抗体通过Western blot显示结合蛋白。(e)来自SUM149细胞的全细胞提取物的共免疫沉淀显示EZH2与PRC2成员SUZ12和EED结合p38/p-p38。提取物用EZH2、p38、p-p38、EED、SUZ12或对照IgG进行免疫沉淀,并通过针对EZ82、p38,p-p38,EED和SUZ12的抗体通过Western blot显示结合蛋白。
图4
图4。MDA-MB-231细胞中EZH2的敲低足以减少远处转移
(a)MDA-MB-231干扰shRNA对照或EZH2-靶向shRNA[shEZH2]细胞小鼠肺转移的代表性显微照片。EZH2 KD改变了肿瘤的形态,使其从边界差、侵袭性强的区域变为边界小的病灶。星号表示转移癌包裹的血管。箭头表示MDA-MB-231 shEZH2细胞形成的转移。抗CK-18和抗Snail1抗体的双重免疫染色显示,与对照组相比,shEZH2转移瘤的癌细胞核中CK-18表达上调,Snail1表达降低【H&E:200倍放大;H&E-Inset:400倍放大;CK-18&Snail1,EZH2:600倍放大】。(b)EZH2 KD显著降低了每只小鼠的肺转移数量。结果显示,与对照组相比,MDA-MB-231 shEZH2细胞形成的肺转移明显较少。晶须表示每种情况下每只小鼠的最小和最大肺转移数[学生t检验,*p<0.05]。(c)左边,MDA-MB-231对照组和shEZH2细胞的肺转移显微照片显示p-p38蛋白降低[放大600倍]。右,条形图显示shEZH2中的p-p38蛋白表达±SEM,并使用FRIDA软件量化控制肺转移[Student’s t-test,*p=0.01]。
图5
图5。与来自同一患者的匹配原发肿瘤相比,EZH2和p-p38在人类乳腺癌转移中显著上调
(a)对匹配的原发性乳腺癌和转移癌(n=16例)的代表性图像进行EZH2免疫染色[100倍放大,插图:400倍放大]。与原发肿瘤相比,EZH2在转移中上调。(b)两个转移瘤的代表性图像显示一致的高EZH2和p-p38表达[放大600倍](c)该表显示了EZH2和p-p38蛋白在16例原发性乳腺癌和匹配转移瘤中的表达分布;62.5%的转移瘤表现出EZH2和p-p38的高表达。

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