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.2013年4月；20(4):515-24.
doi:10.1038/nsmb.2528。 Epub 2013年3月24日。

Staufen1通过一个保守的基序和一个退化的dsRNA结合结构域二聚化以促进mRNA衰变

迈克尔·L·格里霍恩 1, 晨光宫, 克拉拉·基尔科夫, Lynne E Maquat公司
附属公司

Staufen1通过一个保守基序和一个退化的dsRNA-结合域二聚化，促进mRNA衰变

迈克尔·L·格雷霍恩等。 自然结构分子生物学. 2013年4月.

摘要

Staufen1（STAU1）介导的mRNA衰变（SMD）降解哺乳动物细胞mRNA，这些mRNA在其3'非翻译区结合双链RNA（dsRNA）结合蛋白STAU1。我们报道了一个新的基序，它代表了所有脊椎动物类的STAU同源物，负责人类STAU1（hSTAU1）同源二聚体。我们的晶体结构和突变分析表明，这个我们命名为Staufen-swapping基序（SSM）和dsRNA-binding domain 5（'RBD'5）的基序介导蛋白质二聚：一个分子的两个SSMα-螺旋主要通过疏水补丁与第二个分子的二个'RBD'5α-螺旋相互作用RBD’5采用功能性RBD的典型α-β-β-α折叠，但缺乏结合双链RNA所需的残基和特征。在细胞中，SSM介导的hSTAU1二聚体通过增强hSTAU1-ATP-依赖性RNA解旋酶hUPF1的结合来提高SMD的效率。二聚体调节角质形成细胞介导的伤口愈合和许多其他细胞过程。

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数字

图1
图1
脊椎动物STAU序列比较和hSTAU1 SSM-‘RBD’5的X射线晶体结构。(一)人（h）STAU1的模块化组织55真dsRNA-结合域（RBD）3和4、退化的“RBD”2（结合微管蛋白（TBD）的区域）的相对位置在体外（氨基酸282–372）和STAU交换基序（SSM）-‘RBD’5区域（氨基酸367–476）。hSTAU1的二级结构55用蓝色表示的数据来源于这里报告的数据，虚线表示晶体结构中缺失的397–402氨基酸。(b条)表示为单个hSTAU1的X射线晶体结构55SSM-“RBD”5分子（左，蓝色），作为一个域摆动二聚体，与晶格中的另一个分子形成（右，绿色）。星号表示连接器的另一种构造（补充图2c）。由于多重构象和/或晶体结构中的无序性，SSM和“RBD”5之间无法建模的连通性用虚线表示RBD’5结构元件下划线。(c（c）)SSMα螺旋（绿色α1和α2）和‘RBD’5α螺旋（蓝色α1和β2）之间的相互作用特写。重要残留物显示为棒状表示并标记。形成疏水核心的残留物是黄色的。极性原子之间的氢键用虚线表示。(d日)SSM Arg376和‘RBD’5主链氧之间的极性相互作用，其中SSM为绿色，‘RBD'5为蓝色，关键残基和柠檬酸离子配体（橙色）显示为棒状物并标记。氢键显示为虚线。
图2
图2
hSTAU1的比较55“RBD”5带有结合dsRNA的RBD(一)hSTAU1‘RBD’5（绿色）和超嗜热菌RNase III RBD（灰色）使用Dali。(b条)基于结构的hSTAU1序列比对55“RBD”5（顶部绿色序列）和超嗜热菌RNase III RBD（底部灰色序列）。保守的氨基酸在橙色盒子里。文本中讨论的关键残留物用箭头表示。两种蛋白质之间区域3内结构上对应的残基如果带正电荷则为蓝色，如果带负电荷则为红色。(c（c）)X射线晶体结构超嗜热菌发夹内RNase III RBD与dsRNA复合。蛋白质呈灰色，呈卡通状，dsRNA呈粘贴式表达。典型RBD的三个主要dsRNA相互作用区域使用编号为1-3的圆边外壳进行近似，以说明重要的二级结构。(d日)卡通的结构超嗜热菌RNase III RBD与dsRNA（左）或STAU1结合55“RBD”5叠加在超嗜热菌RNase III RBD，并且在超嗜热菌RNase III RBD与dsRNA结合（右）。使用PyMOL生成真空静电势以说明电荷变化，其中每个蛋白质的表面代表蓝色为正，红色为负，白色为中性。三个主要的dsRNA相互作用区域包括如下c（c）.
图3
图3
hSTAU1号机组55SSM-“RBD”5是溶液中的二聚体(一)SSM-‘RBD’5的凝胶过滤分析，其中显示了尺寸标记和SSM-“RBD”5二聚体的位置。(b条)分析超速离心结果支持SSM-“RBD”5单体-二聚体在溶液中平衡存在的模型。归一化的表观沉降系数分布（g（s*））绘制为表观Svedbergs（s*”）的函数。
图4
图4
‘RBD’5和SSM在反式，两者的表达均抑制hSTAU1二聚体和SMD。(一)分析了EGFP标记和mRFP标记蛋白质的图表。非阴影区域源自hSTAU155. (b条)使用HEK293T细胞特定抗体在IP前（−）或IP后使用抗GFP裂解产物进行Western blotting，或为控制非特异性IP，使用小鼠（m）IgG（补充表2）。来自细胞的裂解物（1×107每150 mm培养皿中的细胞数）。最左边的四个通道分析IP前裂解液的三倍稀释。(c（c）)如中所示b条使用HEK293T细胞的裂解物（1×107)pcI-neo-hSTAU1瞬时转染55（右）-标记（1μg），phSTAU155-透明质酸三（10μg）和pmRFP-“RBD5”（5μg）或pmRFP（5μg）。(d日)HEK293T细胞（1×10）裂解物的Western blotting（上部）和RT-PCR直方图（下部；附图4d）7)瞬时转染无质粒（−）或5μg pmRFP、pmRFP-‘RBD’5、pEGFP或pEGFP-SSM。RT-PCR后，将每个细胞SMD靶的水平标准化为GAPDH公司mRNA，无质粒存在时的标准化水平为100。所有结果都代表了三个独立进行的实验。误差条，s.e.m.*，n=3，P<0.05，使用单尾法确定t吨-测试。
图5
图5
hSTAU1不需要序列C末端到‘RBD’5α155二聚和二聚促进hUPF1结合和SMD。(一)hSTAU1示意图55（右）-FLAG变体。(b条)RNase A处理的HEK293T细胞裂解物在IP前（−）和IP后使用抗FLAG或小鼠（m）IgG进行Western blotting。电池（1×107每150 mm培养皿中的细胞）瞬时转染10μg phSTAU155-透明质酸三和1μg pcI-neo-hSTAU155（右）-标记重量，Δ（C-Term）或Δ（SSM-‘RBD’5）。(c（c）)Western blotting（补充图5a），其中黑色符号表示hSTAU1带，以及(d日)HEK293T细胞（1×10）的RT-PCR分析直方图（补充图5e）7)用指定的siRNA（100 nM）瞬时转染，两天后用指定的抗siRNA hSTAU1转染55（右）-FLAG表达载体或pcI-neo（1μg）；pFLUC-SMD报告子构建物（3μg）和pRLUC参考质粒（3μg）。对于直方图，每个mRNA的水平标准化为RLUC的水平（对于FLUC-SMD报告mRNA）或GAPDH公司mRNA（细胞mRNA）和标准化水平表示为存在对照siRNA时标准化水平的百分比，即100。结果代表了三个独立执行的实验。误差线，s.e.m.*，n=3，P<0.05，使用单尾t吨-测试。
图6
图6
hSTAU1号机组55破坏二聚化的点突变抑制hUPF1结合和SMD，从而阻止SMD对抑制细胞运动的作用。(a–c)基本上如图5b–d所示，但使用指定的siRNA-resistant hSTAU1除外55（右）-FLAG表达质粒。对于(c（c）)RT-PCR分析参见补充图6e。误差条，s.e.m.*，n=3，P<0.05，使用单尾法确定t吨-测试。(d、 e（电子）)HaCaT角质形成细胞（5×106细胞/100 mm培养皿）用指定的siRNA（100 nM）瞬时转染，一天后用指定的质粒（3μg）瞬时转染。(d日)擦伤前对裂解物进行蛋白质印迹，以及(e（电子）)刮伤细胞的相控显微镜观察，刮伤后即刻（0h）和16h进行分析。比例尺代表100μm。
图7
图7
hSTAU1二聚体如何将hUPF1招募到靶向SMD并促进其衰变的mRNA的3′UTR的模型。hSTAU1可以与STAU1结合位点（SBS）结合，这里显示为mRNA 3′UTR（上部）与长的非编码RNA（下部）的碱基连接形成的分子间SBS，但也可以通过分子内碱基连接而形成，如果不是多聚体，则为二聚体，具体取决于SBS的长度。二聚体由一个hSTAU1分子（蓝色）的SSM和另一个hSTAU1分子（绿色）的“RBD”5之间的域摆动相互作用介导，并且反之亦然注意，“RBD”2也可能促进hSTAU1–hSTAUl二聚体化，这可能改变hSTAU1-二聚体的取向。hSTAU1二聚化促进hUPF1结合。结合激活UPF1解旋酶活性并启动mRNA衰变。7米G、 7-甲基鸟苷帽；AUG，翻译起始密码子；Ter，正常终止密码子；A类n个，聚（A）尾。为了强调，分子没有按比例显示。
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