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.2013年4月17日；32(8):1115-27.
doi:10.1038/emboj.2013.52。 Epub 2013年3月19日。

粗糙的内质网是siRNA介导的RNA沉默的中心成核位点

卢卡斯·斯塔德 1, 沃尔夫·赫斯曼, 莉娜·索科尔, 多米尼克·特罗杰, 乔尔·沃兹, 贾斯汀·希恩, 安妮娅·弗里茨（Anja Fritzsche）, 弗洛里安·埃斯奇曼, 维拉·普范扎格尔, 帕斯卡·巴斯莱特, 简·韦勒, 马丁·辛特施泰纳, 大卫·V·莫里西, 妮可·梅斯内·科伯
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粗糙的内质网是siRNA介导的RNA沉默的中心成核位点

卢卡斯·斯塔德等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

尽管在RNA干扰（RNAi）途径的机制理解方面取得了进展，但RNA沉默的亚细胞位点仍存在争议。在这里，我们发现脂质转染的siRNA和内源性microRNA（miRNA）加载到RISC（RNA诱导沉默复合物）中，靶mRNA的遭遇和Ago2介导的哺乳动物细胞中的mRNA切片在粗糙内质网（rER）处成核。虽然主要的RNAi途径蛋白存在于大多数亚细胞隔室中，但miRNA和siRNA-loaded Ago2群体几乎完全与rER膜、RISC负载复合物（RLC）因子Dicer、TAR RNA结合蛋白（TRBP）和干扰素诱导蛋白激酶（PACT）蛋白激活剂共同沉积。分级和膜共免疫沉淀进一步证实了siRNA负载的Ago2与rER膜的胞质侧物理结合。此外，RLC-相关的双链siRNA、RISC负载的诊断以及RISC介导的mRNA切割产物仅与rER共沉积。最后，我们确定TRBP和PACT是以RNA-independent方式将RISC锚定在ER膜上的关键因素。总之，我们的发现表明，外rER膜是siRNA-介导RNA沉默的中心成核位点。

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数字

图1
图1
Ago2和siRNAs定位于许多不同的隔间。(A类)蔗糖梯度组分的Western blot分析。(B类)HeLa细胞的免疫荧光用抗Ago2染色，并用P小体（Dcp1）、ER（钙网蛋白）、高尔基体（β4-GalT1）、ERGIC（p58）和早期内切体（Hrs）标记蛋白抗体进行反染色。选择的设置是为了从只被二级抗体染色的细胞中检测不到背景，所有图像都是在相同的设置下拍摄的。(C类)RT-qPCR定量转染后指定时间点细胞内SSB导向链总量（左面板）和蔗糖组分（右面板）。(D类)用5′TMR标记的HuR siRNA（绿色）转染并用Lysotracker（溶酶体标记物；蓝色）或转铁蛋白（内体标记物；红色）复染的HeLa细胞的生命细胞成像。
图2
图2
过多的非活性siRNA掩盖了活跃人群。(A类,B类)Ago2 IP以定量方式进行24 用SSB siRNA转染HeLa细胞后h。用RT-qPCR从纯化的总RNA中测定mRNA水平。
图3
图3
siRNA-和miRNA-负载的Ago2复合物和mRNA切片产品与ER/高尔基体膜共同沉积。(A类)从图1A所示的蔗糖梯度部分进行Ago2-IP，并通过RT-qPCR对SSB siRNA引导链、miR-16和miR-21进行定量。(B类)利用图1A所示梯度的每个蔗糖梯度部分的总RNA进行5′RACE。PCR产物在琼脂糖凝胶上分离，阳性5′RACE信号产生208-bp片段。
图4
图4
活性siRISC与膜的外部相关。用SSB siRNA转染HeLa细胞，并进行膜漂浮测定。通过western印迹分析组分(A类)、Ago2 IP和RT–qPCR(B类)和5英尺赛道(C类)如图3所示。(D类)用RNAseA或ProteinaseK处理HeLa裂解产物，并进行膜漂浮分析，通过western blotting分析组分。通过分析处理后蔗糖梯度组分中的GAPDH mRNA水平，确认RNA酶A活性（补充图S3C）。
图5
图5
siRISC负载和siRNA-介导的mRNA切割发生在粗糙内质网的膜上。(A类)用HeLa裂解物（如材料和方法中所述）进行膜IPs，并通过蛋白质印迹分析洗脱物。(B类)用SSB、HuR和pGL3 siRNA转染HeLa细胞，并施加蔗糖沉淀梯度。通过western blotting、Ago2 IP和RT–qPCR分析组分(C类)和5英尺赛道(D类). (E类)转染HuR siRNA的HeLa细胞受到蔗糖沉淀梯度的影响(A类). 将高尔基体/P-体组分（2-4）和rER组分（8-10）合并用于TRBP、Dicer和Ago2 IP。用RT-qPCR分析洗脱液。显示了一个典型实验的平均值，误差条表示RT–qPCR的标准偏差。(F类)将双核糖核酸酶报告质粒与浓度增加的HuR siRNA共同转染，24小时后测定荧光素酶活性 小时。
图6
图6
TRBP/PACT对RISC的膜锚定加速RNA沉默。(A类)对耗尽TRBP或PACT的HeLa细胞进行膜漂浮分析，如图4A所示，通过western blotting分析组分。(B类)用SSB siRNA转染缺失TRBP和/或PACT的HeLa细胞，并在指定的时间点后收获。相对SSB mRNA水平，归一化为GAPDH mRNA，通过RT-qPCR定量。(C类)HeLa细胞用诺可唑（5 μg/ml）或Brefeldin A（10 μg/ml）2 h、 以0.5转染SSB siRNA nM，并在转染后的指定时间点裂解。用RT-qPCR分析SSB mRNA水平。
图7
图7
RNAi途径的空间组织模型和转染后siRNA的定量命运。(A类)基于本研究中的数据，我们认为RNAi的中心步骤发生在rER膜的细胞溶质表面。直接或间接通过TRBP和/或PACT锚定在细胞膜上的ds-siRNA暴露于RLC，在rER（1）处所有伴侣相遇后形成核。当ds-siRNA从RLC转移到Ago并去除乘客链（RISC加载和成熟）时，（2）成熟的RISC形成。rER关联为成熟的RISC提供了一个特权位置，可以对与rER永久（分泌/膜蛋白）或瞬时（可溶性蛋白）关联的过度翻译活性mRNA进行采样（Lerner等人，2003；Gerst，2008；Chen等人，2011）。当遇到靶mRNA时，siRNP或miRNP形成有核（3a），理想靶被Ago2（3b）内切。考虑到以前的报告，RISC相关RNP可能会进一步定向到下游沉默事件的效应器位点（4），例如暴露于mRNA降解机制的P-体（Eulalio等人，2007a），或与GW蛋白和/或RISC分解相互作用的MVB/GW体（Gibbings和Voinnet，2010）。最后，“消耗的”RISC可能被消除，或被重新激活，并通过高度动态的内膜装置或其他途径再循环回内质网（5）。(B类)综上所述，图1和补充图S2所示的数据，在内胚体通过阳离子脂质感染摄取siRNA后，大部分细胞内siRNA通过溶酶体和潜在的额外分泌或降解途径再次迅速清除。尽管RISC加载机制未饱和（图2A），但剩余的细胞内siRNA加载到Ago中的效率非常低（小于初始细胞内siRNA的0.1–1%）。这解释了为什么，尽管每个细胞只有10–110个负载的RISC分子足以促进相对丰富的mRNA（如SSB）的敲除，但细胞需要通过暴露于纳米摩尔浓度来充满siRNA，以维持显著的mRNA敲除。
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