Increased expression of enzymes of triglyceride synthesis is essential for the development of hepatic steatosis

doi:10.1016/j.celrep.2013.02.009

.2013年3月28日；3(3):831-43.

doi:10.1016/j.celrep.2013.02.009。 Epub 2013年3月14日。

甘油三酯合成酶的表达增加对肝脏脂肪变性的发展至关重要

金晶凌¹, 波琳娜·亚科娃, 梅根·布鲁, 艾米莉·沙利文, 尼科尔·贾万马尔迪, 陈大虎, 姜艳军（Yanjun Jiang）, 埃斯特拉·梅德拉诺, 尼古拉·蒂姆琴科

附属公司

PMID： 23499441
预防性维修识别码： PMC3615099型
内政部： 2016年10月10日/j.celrep.2013.02.009

增加甘油三酯合成酶的表达对肝脂肪变性的发展至关重要

金晶凌等。单元格代表. 2013.

.2013年3月28日；3(3):831-43.

doi:10.1016/j.celrep.2013.02.009。 Epub 2013年3月14日。

作者

金晶凌¹, 波琳娜·亚科娃, 梅根·布鲁, 艾米莉·沙利文, 尼科尔·贾万马尔迪, 陈大虎, 姜艳军（Yanjun Jiang）, 埃斯特拉·梅德拉诺, 尼古拉·蒂姆琴科

附属

¹美国德克萨斯州休斯顿市贝勒医学院赫芬顿老龄中心和病理免疫系，邮编77030。

PMID： 23499441
预防性维修识别码： PMC3615099型
内政部： 2016年10月10日/j.celrep.2013.02.009

摘要

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的分子机制尚不清楚。NAFLD的最早阶段是肝脏脂肪变性，这是肝脏衰老的主要特征之一。在这里，我们提出了年龄相关性肝脂肪变性的分子方案。我们发现C/EBPα-S193D敲除小鼠具有年龄相关的表观遗传学改变，并在2个月大时发生肝脂肪变性。老年野生型（WT）小鼠和年轻S193D小鼠肝脂肪变性的潜在机制包括p300-C/EBPα/β三元复合物的增加，其激活驱动甘油三酯合成的五个基因的启动子。敲低老WT小鼠的p300可抑制肝脂肪变性。事实上，表达显性阴性p300的转基因小鼠具有较少的C/EBPα/β-p300复合物，并且不会发生年龄依赖性肝脂肪变性。值得注意的是，p300-C/EBPα/β途径在NAFLD患者的肝脏中被激活。因此，我们的结果表明p300和C/EBP蛋白是肝脂肪变性的重要参与者。

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数字

图1
幼年S193D小鼠在2个月大时出现肝脏脂肪变性。**答：。**用油红O染色2个月龄（年轻）S193D小鼠的肝脏和24个月龄WT小鼠的肝脏。比例尺：10μm。B。幼年S193D和老年WT小鼠血清（上部）和肝脏（下部）中的TG含量增加。条形图显示了每个基因型和每个年龄组八只小鼠的分析结果。*p＜0.05、S193D与WT相比，^#老年人与年轻人相比p<0.05。**C、。**S193D小鼠和老年WT小鼠肝脏中TG合成酶的mRNA水平升高。用从年轻WT和S193D小鼠肝脏（上图）和从WT老年小鼠肝脏（下图）分离的RNA进行Q-RT-PCR。D。S193D小鼠肝脏中GPAT、DGAT1和DGAT2的蛋白质水平增加。用从年轻WT和S193D小鼠（上部）和老年WT小鼠（下部）肝脏分离的蛋白质提取物进行蛋白质印迹。每个膜都用β-肌动蛋白抗体进行再防护。**E.公司。**用DGAT1和DGAT2抗体对年轻WT、年轻S193D和老年WT小鼠的肝脏进行免疫染色。请注意，老WT小鼠和年轻S193D小鼠的肝脏肝细胞增大（Jin等人，2010年）。比例尺：10μm。**F、。**年轻WT、年轻S193D和老年WT小鼠肝脏中DGAT1-和DGAT2-阳性肝细胞的数量。条形图显示了每组三只动物的分析结果。*p<0.05，**p<0.01，老年WT与年轻WT，^#p<0.05年轻S193D与年轻WT。

图2
p300-C/EBPα/β复合物占据并激活S193D小鼠肝脏中驱动TG合成酶表达的基因启动子。**答：。**GPAT、DGAT1、DGAT2、MGAT2和AGPAT1的启动子包含C/EBP位点。显示了具有位点的C/EBP的位置和序列。B。用DGAT2探针和S193D小鼠肝细胞核提取物进行电泳迁移率变化分析。结合反应包括C/EBPαμ和C/EBPβ抗体。显示了C/EBPα/β复合物和超位移（SS）的位置。C类C/EBP蛋白在S193D小鼠和老WT小鼠的肝脏中向DGAT1和DGAT2启动子募集p300。从染色质溶液中免疫沉淀C/EBPα、C/EBPβ、p300、Lys9乙酰化或Lys9三甲基化组蛋白H3，并用扩增DGAT1和DGAT2启动子上C/EBP位点的引物进行PCR反应检测。在；1/100输入。D类高分子量p300-C/EBPα/β复合物在年轻S193D小鼠的肝脏中大量存在。WT和S193D肝脏的核提取物通过尺寸排除色谱分离。尺寸排除标记的位置显示在顶部。p300和C/EBP蛋白在组分中的位置通过特异性抗体的Western blotting测定。C/EBPα-IP；从每个组分中免疫沉淀C/EBPα，在这些IP中检测到p300和C/EBPβ。**E.公司。**用编码α、β或两者的单个DNA转染的细胞中C/EBPα和C/EBPβ蛋白的数量。在同时转染α和β的情况下，使用单个（α或β）转染中使用量的一半，以便转染总量等于单个转染α或β中使用量。用C/EBPα和C/EBPβ抗体分离和Western blotting检测总裂解产物。柱状图：C/EBP蛋白水平以与β-肌动蛋白的比率计算。**F、。**p300-C/EBPα/β异二聚体比单个C/EBPα和C/EBPβ蛋白更能激活DGAT1（上部）和DGAT2（下部）启动子。DGAT1-luc和DGAT2-luc报告基因构建物与表达C/EBPα、C/EBPβ或两者蛋白的构建物共转染。在p300被抑制的细胞中进行了类似的实验。图2E和F中的数据表示3-4个独立实验的总结。

图3
p300和p300介导的DGAT1和DGAT2升高是导致老年WT小鼠和年轻S193D小鼠肝脂肪变性的原因。**答：。**siRNA对老年WT小鼠肝脏p300的抑制作用。Western blotting显示p300在接受p300特异性siRNA和对照非靶向RNA（NTG）治疗的小鼠的肝脏和脂肪组织中。β-肌动蛋白是蛋白质负荷的控制因素。B。NTG和p300 siRNA处理的老WT小鼠肝脏油红O染色。**C、。**用siRNA处理到p300的老WT小鼠肝脏中的TG量。条形图是3个独立实验的平均值。D。敲除DGAT1和DGAT2可抑制S193D小鼠的肝脏脂肪变性。使用DGAT1和DGAT2抗体以及从肝脏和脂肪组织分离的蛋白提取物进行蛋白质印迹。β-肌动蛋白显示蛋白质负载。NTG，用对照非靶向RNA治疗S193D小鼠。**E.公司。**交付DGAT1和DGAT2 siRNA后7天肝脏油红O染色的典型图片。NTG；用非特异性RNA处理WT和S193D小鼠。**F、。**条形图显示了用DGAT1和DGAT2 siRNAs治疗的小鼠肝脏中TG的数量，这是三个独立实验的平均值。

图4
在S193D小鼠中，HFD加速了肝脏脂肪变性的发展。**答：。**HFD条件下WT和S193D肝脏H&E（左）和油红O（右）染色的典型图片。上图显示正常饮食（N饮食）下的肝脏染色。比例尺：40μm。**B和C。**HFD不同时间点WT和S193D小鼠血清和肝脏中TGs的数量。每个基因型的三只动物的数据以条形图的形式呈现。D。HFD后肝脏中DGAT1和DGAT2的含量。在HFD发病后3周和12周用分离的蛋白质提取物进行蛋白质印迹。条形图显示DGAT1和DGAT2与β-肌动蛋白的比率。**E.公司。**通过免疫染色检查WT和S193D小鼠肝脏中DGAT2的表达。条形图显示了WT和S193D小鼠肝脏中DGAT2阳性肝细胞的数量。比例尺：10μm。

图5
表达显性负性p300（dnp300）的转基因小鼠不会随着年龄增长和在HFD条件下发生肝脂肪变性。**答：。**产生表达dnp300的转基因动物。显示用于转基因动物生成的CH3结构域定位的方案。B。PCR基因分型凝胶显示三只动物显示转基因的基因组插入。Dn和wt；来自含有显性阴性和野生型cDNA的对照质粒的PCR。Western blotting（底图）显示转基因动物肝脏中c-myc–dnp300的表达。客户关系管理；交叉反应分子。**C、。**转基因小鼠的总脂肪减少。A类对WT和dnp300小鼠进行全身扫描。条形图表示每个基因型的平均5只动物。D。与WT动物（20个月龄）相比，dnp300小鼠（20个月中龄）肝脏中的脂肪滴数量减少。用油红O染色WT或dnp300小鼠的肝细胞。计算WT和dnp300鼠肝脏中脂肪滴的肝细胞数量。条形图显示了每个基因型五只动物的三个重复的摘要。**E.公司。**dnp300破坏老年小鼠肝脏中的C/EBPα/β-p300复合物。在SEC400柱上分离20个月龄WT和dnp300小鼠肝脏的蛋白质提取物。按照图2D的图例所述，对馏分进行分析。**F、。**在HFD方案的12周内，dnp300小鼠未发生肝脂肪变性。

图6
Dnp300抑制S193D小鼠脂肪变性的发展。**答：。**双S193D-dnp300小鼠的基因分型。图中显示了基于PCR的dnp300基因分型，并显示了用BamHI酶消化PCR产物（S193D基因分型）。B。HFD发病12周后WT和S193D-dnp300小鼠肝脏的典型图片。**C、。**肝脏H&E和油红O染色。H&E染色比例尺：40μm。油红O染色比例尺：10μm。D。DGAT2在WT和S193D-dnp300小鼠肝脏中的表达。条形图显示DGAT2阳性肝细胞的数量，每个基因型有三只小鼠，平均重复三次。**E和F。**使用ChIP分析检查DGAT1和DGAT2启动子上的p300-C/EBPα/β复合物。按照图2C图例所述进行ChIP。

图7
非酒精性脂肪性肝病患者的肝脏中C/EBPα-p300-DGAT1/2通路升高。**答：。**产生针对C/EBPα人类p-Ser190亚型的抗体。显示了围绕Ser193和Ser190的小鼠和人类C/EBPα序列。星号表示序列中的差异。底部：用p-Ser190人C/EBPα抗体进行免疫印迹。F+PP2A；脂肪肝患者的蛋白质用磷酸酶PP2A处理。B。使用C/EBPα的p-Ser190同种型抗体对脂肪肝患者的正常肝脏和肝脏进行免疫染色。载玻片用DAPI染色。**C、。**正常患者肝脏和脂肪肝患者肝脏中p-Ser190-C/EBPα阳性肝细胞的百分比。D。NAFLD患者肝脏中p-Ser190-C/EBPα-p300复合物的数量增加。用p-Ser190-C/EBPα抗体、p300抗体和DAPI对相同的肝脏切片进行染色。Merge显示C/EBPα和p300在细胞核内共定位。条形图显示C/EBPα和p300共定位的肝细胞总数，以及多个共定位病灶的肝细胞数量。**E.公司。**脂肪肝患者肝脏中DGAT2的含量增加。肝脏切片用DGAT2抗体和DAPI染色。条形图显示DGAT2阳性肝细胞的百分比。**F、。**显示年龄相关性肝脂肪变性假设机制的模型。

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1. Cohen JC、Horton JD、Hobbs HH。人类脂肪肝：旧问题和新见解。科学。2011;332:1519–1523.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Dansen TB、Smits LM、van Triest MH、de Keizer PL、vanLeenen D、Koerkamp MG、Szypowska A、Meppelink A、Brenkman AB、Yodoi J等。氧化还原敏感性半胱氨酸桥p300/CBP介导的乙酰化和FoxO4活性。自然化学生物。2009;5:664–672.-公共医学
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1. Flodby P、Barlow C、Kylefjord H、Ahrlund-Richter L、Xanthopoulos KG。CCAAT/增强子结合蛋白α缺乏小鼠的肝细胞增殖增加和肺异常。生物化学杂志。1996;271:24753–24760.-公共医学

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