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.2013年3月19日;110(12):E1112-21。
doi:10.1073/pnas.1302184110。 Epub 2013年3月4日。

Arf肿瘤抑制因子和miR-205调节多能干细胞的细胞粘附和胚外内胚层的形成

附属公司

Arf肿瘤抑制因子和miR-205调节多能干细胞的细胞粘附和胚外内胚层的形成

李春亮等。 美国国家科学院程序. .

摘要

癌基因激活后Arf肿瘤抑制因子的诱导(由Cdkn2a位点的交替阅读框编码)涉及p53依赖性转录程序,该程序限制了早期癌细胞的扩张。虽然p19(Arf)蛋白在胎儿或年轻成年小鼠的大多数组织中未检测到,但在胚胎卵黄囊中生理表达,卵黄囊是一种来源于胚胎外内胚层(ExEn)的组织。小鼠p19(Arf)蛋白的表达标志着ExEn在来源于胚胎干细胞或诱导多能干细胞的培养类胚体(EB)中分化的晚期阶段。Arf失活延迟EB内ExEn谱系的分化,但不会延迟来自多能干祖细胞的其他生殖细胞谱系的形成。Arf是及时诱导ExEn细胞响应Ras/Erk信号传导所必需的,反过来,Arf通过p53发挥作用,以确保ExEn谱系的发育,而不是维持。值得注意的是,在Arf-null EB成熟过程中检测到的ExEn分化的显著时间延迟通过小鼠微小RNA-205(miR-205)的强制表达得以挽救,miR-205是一种由p19(Arf)和p53上调的微小RNA,控制ExEn细胞的迁移和粘附。Arf在ExEn发育和肿瘤抑制中的非经典和典型作用可能通过调控细胞粘附和迁移的机制在概念上联系在一起。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
第19页阿尔夫ExEn中的蛋白质表达。(A类)将WT E4.5胚胎固定并用指示的抗体染色,并用共焦显微镜观察免疫荧光。分别用Oct4和Gata4抗体观察内细胞团中的多能干细胞(红色)和分化的原始内胚层细胞(绿色);第19页阿尔夫未检测到蛋白。DAPI用于细胞核可视化。(比例尺,25µm)(B类)从子宫蜕膜恢复的WT胚胎切片E7.5染色如上。第19页阿尔夫-ExEn阳性细胞(绿色,星号)环绕Oct4-阳性外胚层(红色)。(比例尺,200µm,上部; 100微米,下部.) (C类)冷冻切片的WT EB如上所示进行染色和可视化。p19的表达阿尔夫(绿色)和Bmi1(红色)在EB外围的单个ExEn细胞层中共定位(黄色)。(比例尺,50µm)(D类)世系追踪。在细胞调控下用Cre敲除小鼠阿尔夫启动子与一株指示菌株杂交,该指示菌株表达LacZ,以响应Cre介导的“lox–stop–lox”盒切除。从这些囊胚中获得的ES细胞被诱导分化为EB。在表达Arf–Cre的EB的外围检测到β-半乳糖苷酶(下部; 放大倍数:50倍)。
图2。
图2。
ExEn细胞的延迟形成阿尔夫-无效EB。(A类B类)重量(A类)和阿尔夫-空(B类)对EB进行免疫荧光处理。阿尔夫已停用。DAPI染色细胞核。蓝色细胞的强烈光晕B左上是依赖于共焦平面的伪影;这些细胞表达Oct4(左下方). (比例尺,50µm)(C类)WT和三个混合的裂解产物的免疫印迹阿尔夫-悬浮培养4d后产生的空白ES细胞衍生EB在所示蛋白的表达上表现出数量差异。(D类)用所示抗体进行免疫印迹显示阿尔夫-空白EB在培养4天后表达极低水平的ExEn标记物Dab2,但培养10天后恢复了Dab2的表达。(E类)EB来源于功能阿尔夫-无效阿尔夫G公司fp/Gfp培养10天后,ES细胞在其表面表达Gata4-阳性ExEn细胞。(放大倍率:50倍)激活细胞阿尔夫不表达p19的“GFP敲除”细胞中的启动子阿尔夫该蛋白伴随着GFP信号,与Gata4标记的ExEn细胞在外周共定位。
图3。
图3。
Ras/Erk信号促进阿尔夫-依赖性ExEn分化。(A类)WT和阿尔夫-用表达所指示的Ras突变体的载体或对照(Ctl)载体转导空iPS细胞(如左图所示),在含有LIF的培养基中选择嘌呤霉素抗性,并在缺乏LIF的情况下诱导分化4天。一个向Erk发出信号的组成性活性Ras效应器突变体(G12V/T35S)促进了WT中ExEn细胞的形成,但没有阿尔夫-null,iPS祖细胞,一种被显性阴性突变体(HRas–S17N)阻断的效应。显示了相位对比度图像。(比例尺,200µM。)(B类C类)定量PCR(qPCR)分析(B类)和免疫印迹(C类)证实感染G12V/T35S-Ras突变株(简称T35S)的WT细胞中Dab2 mRNA和蛋白上调。(D类)在两个细胞的外围均检测到活化的磷酸化标记阿尔夫-从不同的iPS祖细胞产生的null和WT第4天EB。(比例尺,200µm)
图4。
图4。
阿尔夫和p53–ER促进ExEn标记蛋白的表达。(A类)WT MEF(左车道)或通过矢量编码转导的细胞的裂解物阿尔夫用针对p19的抗体对外显子1β序列(中心车道)或裸对照载体(右车道)进行免疫印迹阿尔夫(上部)或到ER盒(下部). 内源性p19阿尔夫在所有三个样本中都检测到了蛋白,而50-kDa小基因编码的融合蛋白仅在中间通道中检测到。星号表示染色伪影。(B类)阿尔夫-用编码阿尔夫——外显子-对1βminigene进行qPCR分析。扩增ER部分的引物证实了用不同浓度的三苯氧胺(TAM;见图例)处理的细胞中矢量编码RNA表达水平大致相等。转导的Dab2和Gata4 mRNA阿尔夫-小基因表达和三苯氧胺治疗导致iPS细胞无效,Nanog表达降低。误差线,平均值±SEM(n个=3个实验)。(C类)相位对比显微照片显示,EB来源于第53页-iPS单元为空(赖特)未能表达WT-EB中显示的ExEn细胞晕(左侧). (D类)第4天的EB来源于阿尔夫-iPS单元为空,第53页-与WT iPS对照组相比,空白iPS细胞的Dab2蛋白水平降低。(E类)尽管p19阿尔夫在来源于第53页-iPS细胞为空,未检测到Gata4和Dab2。相反,在外围观察到Oct4-阳性细胞。(比例尺,200µm)(F类)阿尔夫-用表达HRas–G12V/T35突变的逆转录病毒载体转导无效iPS细胞。共表达p53–ER的细胞TAM公司(居中赖特)用三苯氧胺治疗(赖特)或者不是(居中)流式细胞仪分析Dab2表达。观察到Dab2表达增加的细胞百分比。
图5。
图5。
嵌合EB中ExEn细胞的自我分选。(A类)用相差显微镜观察ExEn细胞的形态。(放大倍数:100×。)(B类C类)蛋白质的免疫印迹(B类)和转录物的PCR分析(C类)在WT ES或ExEn细胞系中。(D类)表达p19的WT-ExEn细胞阿尔夫将表达GFP的载体与等量的阿尔夫-无效ES细胞,并在缺乏LIF的情况下悬浮以形成嵌合EB。悬浮两天后,收集EB,冷冻切片,并用所示蛋白的抗体染色。标记的ExEn细胞自发分选到嵌合体EB的外围,并在内部质量中与DAPI标记的ES细胞完全分离。(标尺,100µm)
图6。
图6。
miR-205由阿尔夫并增强WT ES祖细胞的ExEn形成。(A左边)表达Dox诱导物的Arf154 ES细胞阿尔夫在没有LIF和Dox的情况下培养shRNA以形成EB,导致少量减少(P(P)<0.01),通过PCR定量miR-205 mRNA表达。WT ES细胞不受Dox的影响。误差线,平均值±SEM(n个=3个实验)。(赖特)阿尔夫-用转导的空ES细胞阿尔夫——外显子-1β——急诊室TAM公司诱导形成EB,同时用三苯氧胺(TAM)治疗4d(B类)V1载体转录嵌入miR-30骨架中的miR-205(发夹),而V2载体表达完整的前miRNA序列(灰色矩形)。载体包括PGK启动子驱动的盒和编码的新霉素抗性(Neo第页); GFP从内部核糖体进入位点(IRES)翻译而来。显示了病毒整合和病毒启动子驱动mRNA表达所需的长末端重复序列(LTR)和psi-2(φ)病毒粒子包装序列。(C类)WT ES细胞感染对照载体(Ctl-GFP;左侧)或使用miR-205矢量(居中赖特)维持在LIF中以延缓分化。尽管如此,miR-205的强制表达产生了形态改变的细胞,使人想起ExEn细胞。(放大倍数:100×。)(D类)中显示的单元格C类下调多能性标记Nanog并上调ExEn标记Dab2。(E类)对感染的WT iPS细胞(左两条)进行更全面的定量RT-PCR分析显示,其他ExEn标记Gata4和Sox7上调,但其他细菌细胞层(中胚层T、外胚层Fgf5和滋养层Cdx2)标记的表达无明显变化。如预期,第19页阿尔夫p53和p53应答基因p21Cip1号机组在细胞承担ExEn命运时被诱导。相反,在已建立的ExEn细胞系(右两条)中强制表达miR-205并不影响上述基因的mRNA表达。
图7。
图7。
miR-205诱导ExEn的形成阿尔夫-空ES祖细胞。(A类)阿尔夫-感染裸对照(Ctl)GFP载体或编码miR-30骨架miR-205的载体与GFP的空ES细胞在感染后第2天进行分类,置于培养基中,2天后在50倍放大的相差显微镜下观察(左侧)或100×(赖特). 具有ExEn细胞特征形态的细胞对miR-205产生反应。(B类)来自WT的EB或阿尔夫-对空白ES细胞和感染对照或miR-205编码载体(如顶部所示)的细胞进行Dab2蛋白表达染色。WT电池(左侧)和阿尔夫-用miR-205转导的空EB(赖特)在其外围表达Dab2,而阿尔夫-空白细胞,无论是未感染的还是用控制载体转导的,都没有(左起第二和第三个)。(比例尺,50µm)(C类)定量RT-PCR用于量化载体转导的五个ExEn标记(顶部显示)的mRNA表达阿尔夫-在LIF(第0天)和由其衍生的EB(第4天)中生长的空白ES细胞。用对照病毒(Ctl)或编码miR-205(205)的载体转导细胞,如图例所示。误差线,平均值±SEM(n个=3个实验)。
图8。
图8。
基因表达谱分析阿尔夫-用miR-205转导的空ES细胞和EB。阿尔夫-将感染了仅表达GFP的逆转录病毒载体(Ctl)或同时表达miR-205和GFP的载体的空ES细胞分选为GFP表达,在LIF(指定ES)存在的情况下进行电镀,或在没有LIF的情况下诱导4天形成EB(指定EB)。使用荧光标记的分离RNA来探测Affymetrix小鼠基因芯片(1.0版)。对样本中的数据进行归一化(Z分数转换),以便A类C类、和D类单位为SD(A类)热图中显示的是632个探针组,它们被显著上调(红色)或下调(绿色),具有两倍或更多的变化。对照ES细胞、表达miR-205的ES细胞、对照EB和表达miR-203的EB分别显示在热图顶部,并指定为1-4。虽然这些实验不是为了鉴定miR-205直接靶向的基因,但我们在三个公共数据库中选择了最可能的miR-205-小鼠靶基因(miRDB.org网站TargetScan.org网站、和microRNA.org网站)并选择了26个基因进行进一步分析,这些基因被一致排在“前60位”。与所选候选基因相对应的144个探针组中,没有一个在退出LIF前用于比较微阵列分析的表达miR-205的ES细胞表现出超过1.5倍的下调。六个基因[加拿大存托凭证11(另请参见图S2A类),第十一条印刷线路板1Ralyl公司Zfp558型、和Zfp758型]在对照组GFP+ES细胞中没有显著表达。其余候选人包括Acsl1公司阿克纳BC030336号镉1Ccny公司甲型H1N1流感病毒集装箱2数字xl2以斯(Ezr)Lrch3(Lrch3)Lrp1号机组经理1Mllt4号机组Nacc2号机组N脂肪5卢比2号高炉斯达索布1、和斯帕塔13. (B类)qPCR分析证实miR-205转导的EB中两个ExEn标记上调。误差线,平均值±SEM(n个=3个实验)。(C类)与多能性和向除ExEn外的胚层分化相关的基因子集的热图(术语如右图所示)。值得注意的是,Klf4公司Tbx3型左侧2Tdgf1型Ncam1型、和Fgf5型揭示了不到两倍的变化。(D类)细胞粘附相关基因的热图()细胞运动和迁移(ii(ii)). 车道的指定C类D类与中的相同A类该数据已以登录号GSE42210保藏在基因表达综合库(GEO)中。
图9。
图9。
miR-205促进波形蛋白的合成和E-钙粘蛋白的重定位阿尔夫-EB为空。免疫荧光染色阿尔夫-从感染控制载体(Ctl;左侧)和表达miR-205(205;赖特)如图所示。用E-cadherin或vimentin抗体染色的EB和用DAPI可视化细胞核的共聚焦图像被合并。(比例尺,100µm)

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引用人

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