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.2013年3月13日；33(11):4768-81.
doi:10.1523/JNEUROSCI.5555-12.2013。

甘氨酸/GABA混合突触上囊泡递质含量的快速、活性无关的转换

皮埃尔·F·阿波斯托利德斯 1, 劳伦斯·O·特鲁塞尔
附属公司

甘氨酸/GABA混合突触上囊泡递质含量的快速、活性无关的转换

皮埃尔·F·阿波斯托利德斯等。 神经科学. .

摘要

神经递质通过充满递质的突触前小泡融合释放，是神经元传递信息的主要方式。然而，关于提供神经递质以填充囊泡的分子机制、突触前神经末梢内的内源性递质浓度或胞吐后囊泡重新填充的动力学，我们知之甚少。我们通过记录小鼠耳蜗背核的甘氨酸/GABA核释放中间神经元（软骨细胞）的突触耦合对来解决这些问题。我们发现，质膜转运蛋白GlyT2和细胞内谷氨酸脱羧酶分别提供了大部分甘氨酸和GABA。药物阻断GlyT2或谷氨酸脱羧酶导致快速和完全的传播减少，而通过细胞内谷氨酸去壳化增加GABA合成，在1分钟内显著增强GABA释放。这些效应与胞吐无关，令人惊讶，表明预充囊泡在细胞溶质递质的急性变化后重新平衡。用突触后反应滴定细胞溶质递质表明，神经末梢内源性非囊性甘氨酸/GABA水平为5-7 mm，在基础条件下，囊泡转运机制未饱和。因此，胞质递质水平以释放无关的方式动态地设定抑制性突触的强度。

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数字

图1。
图1。
软骨细胞之间的传播主要是甘氨酸。A类，突触连接的车轮细胞之间的配对记录示例表明甘氨酸是该突触的主要神经递质。顶部，单个实验中IPSC随时间的振幅，显示甘氨酸受体拮抗剂士的宁和GABA阻断IPSCA类受体拮抗剂SR95531。底部，本实验的痕迹，在基线条件下（黑色），500 n的存在下，单个突触前动作电位和10个IPSC的叠加米士的宁（蓝色），在士的宁存在下+10μ米SR95531.底部灰色痕迹显示药物洗脱期间IPSC部分恢复。B类，软骨细胞的光诱导激活。在GlyT2中-cre公司注射了ChR2 AAV病毒的小鼠，宽视野蓝光闪烁诱发IPSC爆发，这些IPSC大多被士的宁阻断，类似于配对记录。顶部，实验的时间进程。底部，不同药物条件下诱发的扫描示例。颜色方案与中的相同A类.蓝线表示本实验中20ms光刺激的近似偏移。C类，从配对记录和光遗传学实验中绘制士的宁和SR95531中残留IPSC振幅的汇总数据。士的宁阻滞百分比在两个数据集之间没有显著差异，表明软骨细胞之间的传播主要是甘氨酸。开放的圆圈是个人的实验。红点为平均值±SEM。D类，在没有抑制剂阻滞剂和戊巴比妥+唑吡坦的情况下记录单个mIPSC（以延长GABA的衰变A类组分）显示出衰变动力学谱，并可分为三个基本类别：快速衰变和主要为甘氨酸事件，由GABA介导的缓慢衰变事件A类受体和第三群体同时具有快速甘氨酸能和缓慢GABA能衰变成分。E类，mIPSC的甘氨酸和GABA能成分的相对振幅是通过用含有平均甘氨酸和γ-氨基丁酸的双指数函数拟合在没有抑制剂阻滞剂的情况下记录的单个事件的衰变阶段来测量的A类在SR95531或士的宁存在下记录的衰变时间常数（Jonas等人，1998年；Awatramani等人，2005年）。缓慢GABA的振幅A类衰变绘制在x个-轴，而快速甘氨酸成分绘制在年-轴。灰色虚线表示甘氨酸和GABA振幅的2×SDA类甘氨酸和GABA的衰变成分和低于临界值的事件A类振幅被归类为去核甘氨酸/GABA。平均而言，在没有抑制剂阻滞剂的情况下记录的事件中，19.3±2.2%被归类为混合甘氨酸/GABA mIPSC(n个=14个单元格）。数据来自两个单独的单元格。F类，mIPSC是从与E类，但在一个或另一个细胞中添加士的宁（蓝色点）或SR95531（红色点）后。阻断任一GABA后，大多数mIPSCs降至2×SD线以下A类或含有SR95531或士的宁的甘氨酸受体。插图显示了SR95531或士的宁中记录的甘氨酸和GABA能mIPSC的平均值。注意动力学与记录的纯甘氨酸和GABA事件相似(D类).G公司，14个实验的总结数据与D–F型红色点为平均值±SEM***第页=0.00001，成对t吨测试。
图2。
图2。
GlyT2提供了用于填充循环囊泡的大多数甘氨酸。A–C在浴中应用GlyT2抑制剂ORG25543会导致与突触前活动无关的甘氨酸能传递迅速且接近完全衰减。左，故障时间进程。每个数据点均为标准化平均值±SEM 3–9个单独实验A类，8-10个实验B类和中的2-3个实验C类对，在基线期（黑色）和ORG25543（红色轨迹）中25–30分钟后诱发的单个实验中IPSC的平均值。A类在整个实验中，IPSC在0.07 Hz下被激发。B类，在大多数药物应用过程中都会暂停活动，每隔约10分钟定期检测传播情况。这些“最小活动”实验的简况与A类.C类，突触前刺激频率从0.07暂时增加到2 Hz，在ORG25543应用的第3-8分钟期间激发572到600个动作电位。当恢复到0.07 Hz刺激时，IPSC衰减不大于A类和B类.D类，总结显示了实验中剩余10–11分钟的分数A–C三种条件之间没有发现显著差异，表明突触前小泡含量与胞质递质的可用性相平衡，而与胞吐无关。黑点表示单个实验的值。红色为平均值±SEM。E类，将外源性甘氨酸添加到全细胞内溶液中，阻断了GlyT2阻滞引起的衰竭，表明ORG25543效应是由于突触前末端甘氨酸可用性的丧失。对，ORG25543（红色）中基线期间（黑色）和25–30分钟后的平均IPSC。每个时间点是4到6个单独实验的归一化平均值±SEM。F类，在使用无甘氨酸内溶液进行全细胞记录期间，甘氨酸能传递保持稳定，表明内源性GlyT2活性足以持续填充突触小泡，即使在长时间透析期间。右侧，第0-3分钟（黑色）和第35-40分钟（红色）的平均IPSC。每个时间点是3到7个单独实验的归一化平均值±SEM。
图3。
图3。
在甘氨酸缺失的软骨细胞中快速恢复传播。A类，切片在1μ米ORG25543持续～2 h。用10μ米SR95531。用含有10 m的内部溶液修补一对侧手翻电池米甘氨酸。数据收集地点t吨=0在进入突触前细胞后<1分钟开始。在分离后的前20分钟内，IPSC振幅迅速增加。对，例如，在突触前甘氨酸透析期间的不同时间，IPSC（每条记录道平均4次扫描）。B类，突触前透析传播的平均时间过程为10米米ORG25543处理切片中的甘氨酸，与A类T=0在突触前突破后2分钟内开始。数据标准化为平均IPSC振幅t吨=20 min，每个数据点为归一化平均值±SEM 6–8个单独实验。
图4。
图4。
GlyT2供应～5 m米突触前终末。A类，细胞溶胶递质浓度决定囊泡填充的程度。基线期间诱发的平均IPSC示例（10μ米SR95531）和70μg甘氨酸受体部分阻断后米SR95531（红色痕迹）在内源性条件下（对照组和细胞外刺激）以及在与实验确定的外源性甘氨酸浓度的配对记录中。最右边的轨迹显示了4.95 m的动力学模型结果米10μ和70μ的糖裂峰及其相对振幅预测米SR95531。B类，总结出IPSC在70μ内的剩余分数米SR95531作为突触前甘氨酸浓度的函数。这些值符合以下形式的希尔方程基线+Y（Y）最大值×(C类C类+欧盟委员会50)n个，使用C类作为浓度，并拟合基线参数（起始振幅），EC50（半最大浓度），n个（坡度参数），以及Y（Y）最大值（峰值响应）。红线的拟合参数为0.12，1.76 m米分别为0.63和0.91。对照组或细胞外刺激观察到的灰条括号阻滞范围，预测～5 m米胞质甘氨酸。C类，利用不同的甘氨酸峰瞬态和70μ米与10μ米进行了比较，如B类.蓝线连接中的实验值B类用于将细胞溶质甘氨酸水平的范围用于模型中分裂甘氨酸的相应预测值。
图5。
图5。
GAD为突触小泡提供大部分GABA。A类，GABA平均值A类IPSCs在突触前细胞破裂后的前2分钟（黑色痕迹）和突触前透析后的25-30分钟（红色痕迹）诱发。每一对红色和黑色痕迹都来自同一个单独的实验。用1m透析突触前细胞米螯合酸导致GABA能量传输几乎完全耗尽。使用对照内溶液进行长时间透析会导致GABA能量传递的部分减少，而外源性谷氨酸会减少GABA能量的传递，而20 m米GABA增强传输。B类，实验的平均时间过程如所示A类每个数据点是每个条件下5-9个单独实验的归一化平均值±SEM。
图6。
图6。
GAD提供GABA的摩尔浓度。A类，平均GABAA类在用螯合酸和不同浓度外源性GABA进行突触前透析期间的单个实验中的IPSC。黑色痕迹是突触前突破后前2分钟内IPSC的平均值，红色痕迹是20-30分钟的平均值。突触前动作电位后的大超极化是由于负电流注入阻止复杂的棘波放电。B类，将20–30分钟后剩余的分数IPSC与添加到突触前移液管溶液中的外源GABA浓度绘制成图。数据标准化为突触前透析后前2分钟内记录的IPSC振幅。点0表示用螯合酸透析，0 m米GABA。20米米GABA数据来自图5中的实验，突触前细胞负载20 m米GABA和无螯合酸。为了估计防止消耗所需的GABA浓度（灰色虚线），数据采用以下形式的S形函数进行拟合基线+ {Y（Y）马克斯/（1+exp（欧共体50−C类)/n个))}，使用C类作为浓度；拟合参数为基线（拟合起始水平），Y（Y）马克斯（峰值），EC50（最大流量一半时的浓度），以及n个（坡度系数）。对于实心红线，这些参数分别为0.02、1.34、4.01 m米和1.8。如文中所述，该等式也用于数据集的折刀分析。
图7。
图7。
囊泡在1分钟内与细胞溶质递质重新平衡，且与活性无关。A类，GABA的时间进程A类5 m记录不同时间点（顶部）的IPSC振幅（底部）和平均记录道米将MNI-笼状谷氨酸添加到突触前内溶液中。突触前全细胞记录在数据收集前约10分钟开始。通过宽场紫外线闪光（500 ms；红线）打开谷氨酸，快速增强GABA能量传输。～20分钟时，突触前活动暂停，谷氨酸第二次未被激活。去盖后3分钟突触前活动恢复，IPSC振幅也同样增强。B–C类，在IPSC在去盖后连续诱发的实验中，去盖效应的平均时间过程(B类)或者在实验中，突触前活动在去盖期间暂停(C类). 每个数据点是11-12个单独实验的归一化平均值±SEM(B类)或6-9个实验(C类).
图8。
图8。
突触后受体密度决定IPSC表型。A类，突触前软骨细胞负载5 m米甘氨酸+7米米GABA重述了内源性，主要是甘氨酸能IPSC表型。切片在ORG25543中预先孵育，用含有5 m的内溶液修补软骨细胞米甘氨酸，7米米GABA和1 m米螯合酸。左，绘制IPSC振幅随时间变化的单个实验的时间进程，表明在这些条件下诱发的IPSC主要被甘氨酸受体拮抗剂士的宁阻断。对，痕迹显示了基线期（黑色，无抑制性阻滞剂）、士的宁（蓝色）和士的宁+SR95531（红色）中该实验的单个突触前动作电位和平均IPSC。灰色痕迹是药物洗脱过程中的部分恢复。B类，绘制士的宁和士的宁+SR95531存在下剩余IPSC分数的汇总数据。开放的圆圈是个人的实验。红色圆圈表示平均值±SEM。数据归一化为基线期间的平均IPSC振幅。C类1 m的充气（10 ms，5 psi）米同一细胞的甘氨酸或GABA显示突触后甘氨酸电流比GABA大约3倍A类电流。痕迹是单个实验的平均值。D类，膨化甘氨酸/GABA概述A类七个电池的电流比类似于C类。开圆是单独的实验。红点表示这些数据的平均值±SEM。
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