GRSF1 regulates RNA processing in mitochondrial RNA granules

doi:10.1016/j.cmet.2013.02.005

.2013年3月5日；17(3):399-410.

doi:10.1016/j.cmet.2013.02.005。

GRSF1调节线粒体RNA颗粒中的RNA加工

亚历克西斯·A·朱丹¹, 米尔科·科彭, 马特乌斯·威德罗, 克里斯·D·罗德利, Robert N Lightowlers公司, Zofia M Chrzanowska-灯笼, Jean-Claude马蒂诺

附属公司

PMID： 23473034
预防性维修识别码：项目经理3593211
内政部： 10.1016/j.cmet.2013.02.005

GRSF1调节线粒体RNA颗粒中的RNA加工

亚历克西斯·A·朱丹等。单元格元. 2013.

.2013年3月5日；17(3):399-410.

doi:10.1016/j.cmet.2013.02.005。

作者

亚历克西斯·A·朱丹¹, 米尔科·科彭, 马特乌斯·威德罗, 克里斯·D·罗德利, Robert N Lightowlers公司, Zofia M Chrzanowska Lightowlers公司, Jean-Claude马蒂诺

附属

¹日内瓦大学细胞生物学系，30 Quai Ernest Ansermet，1211 Genève 4，瑞士。

PMID： 23473034
预防性维修识别码：项目经理3593211
内政部： 10.1016/j.cmet.2013.02.005

摘要

细胞溶质和细胞核中描述了各种特殊结构域；然而，人们对线粒体基质中的分隔作用知之甚少。GRSF1（G-rich sequence factor 1）是一种RNA结合蛋白，以前有报道称其定位于胞浆中。我们发现GRSF1亚型在线粒体基质的离散病灶中积累。这些病灶由新生线粒体RNA组成，还包含RNase P，一种参与线粒体RNA加工的酶。GRSF1被发现与RNase P相互作用，并且是处理经典和tRNA-less RNA前体所必需的。如果没有它，初级RNA转录物的切割是异常的，导致线粒体编码蛋白的表达降低和线粒体功能障碍。我们的研究结果表明，含有GRSF1和RNase P的病灶对应于初级RNA转录物聚合处理的位点。我们将这些大型核糖核蛋白结构称为“线粒体RNA颗粒”

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图1
GRSF1是一种线粒体蛋白（a）GRSF1亚型1和2的示意图。MTS，MitoProt算法预测的线粒体靶向信号(http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html). qRRM，准RNA-再认知基序。RNAi，GRSF1 RNAi1和RNAi2的靶位点。MitoProt，根据MitoProt算法得出的线粒体输入概率。（B） GRSF1亚型的共聚焦分析。HeLa细胞转染GRSF1-isoform1-mCherry（顶面板）或GRSF1-soform2-mCherrry（中面板），并用抗Tom20免疫标记。底部，内源性GRSF1和Tom20在143B细胞中被免疫标记。箭头，GRSF1在线粒体中形成的病灶。（C）将放射性标记的GRSF1亚型在体外翻译成分离的143B线粒体。p，前体。m、成熟。ΔΨm，线粒体膜电位。PK，蛋白酶K。注意，前体GRSF1在～70 kDa而非预测的53 kDa下迁移，成熟GRSF1则在～55 kDa处迁移，而不是预测的43 kDa。（D）蛋白酶K可及性试验后线粒体提取物的免疫印迹分析。PK，蛋白酶K.TX-100，Triton X-100。OPA1是一种固定在内膜上的线粒体膜间空间蛋白；Tom20是一种线粒体外膜蛋白；mtSSB是一种线粒体基质蛋白。注意，成熟内源性GRSF1在大约55kDa处迁移，类似于导入后在体外翻译的GRSF1中迁移（C）。（E）碱性碳酸钠（Na）处理后线粒体提取物的免疫印迹分析₂一氧化碳_三)提取。T、总提取物。S、上清液。P、颗粒。PHB，禁止1。Cyt c，细胞色素*c（c）*.

图2
GRSF1与新生线粒体RNA共聚焦分析（A）用抗GRSF1和抗mtSSB免疫标记的HeLa细胞。箭头，线粒体中GRSF1形成的病灶。底部面板，放大。（B）共聚焦分析转染GRSF1-HA、BrU标记、抗HA和抗BrU抗体免疫染色的HeLa细胞。箭头，线粒体中GRSF1形成的病灶。底部面板，放大。（C）（A）和（B）的量化。数据显示为±SEM（N≥5个细胞，每个细胞≥20个病灶；共分析≥100个病灶）。

图3
GRSF1是线粒体基因表达（A）所必需的。左面板，用对照（Ctrl）或GRSF1 RNAi1处理的143B细胞的免疫印迹分析。右面板，对感染携带空载体（pLKO）或抗GRSF1 shRNA（RNAi2）的慢病毒的143B细胞进行免疫印迹分析。COX1和COX2是线粒体编码的蛋白质。SDHB和Tom20是核编码的线粒体蛋白质。肌动蛋白是一种核编码的细胞溶质蛋白。（B） GRSF1 RNAi1处理的143B细胞中培养基的酸化。两种条件下的细胞数量相同。在GRSF1 RNAi2感染的细胞中也获得了类似的结果（数据未显示）。（C）对照（Ctrl）或GRSF1 RNAi1处理的143B细胞中11个线粒体编码ORF的NanoString分析。RNA14对应双顺反子*MTATP8公司*-*MTATP6*RNA。数据显示为平均值±SEM（n=3）。（D）对照组（Ctrl）或GRSF1 RNAi1处理的143B细胞中GRSF1的NanoString分析。数据显示为平均值±SEM（n=3）。（E）对照（Ctrl）或GRSF1 RNAi1处理的143B细胞中11个核编码蛋白的NanoString分析。数据显示为平均值±SEM（n=3）。（F）对照（Ctrl）或GRSF1 RNAi1处理细胞中12S和16S rRNA的Northern blot分析。TUB，微管蛋白。（G）荧光成像仪定量（E）。数据显示为平均值±SEM（n=3）。（H）³⁵S-标记携带空载体（pLKO）或抗GRSF1 shRNA（RNAi2）的慢病毒感染的143B细胞的线粒体翻译。（I）（H）的荧光成像仪定量。将数据归一化为蓬索S强度，并显示为平均值±SEM（n=4）。

图4
GRSF1与线粒体RNA颗粒中的RNase P相互作用并结垢（A）HEK293T细胞中表达的MRPP1-FLAG和GRSF1-HA的免疫共沉淀。用FLAG抗体或对照IgG（IgG）进行下拉。使用OPA1作为阴性对照。（B）共聚焦分析转染MRPP1-FLAG、BrU标记、抗FLAG和抗BrU抗体免疫标记的HeLa细胞。箭头，线粒体中BrU形成的病灶。底部面板，放大。（C）共聚焦分析转染MRPP1-FLAG、GRSF1-HA和mitoECFP的HeLa细胞，并用抗FLAG和抗HA抗体进行免疫标记。箭头，线粒体中GRSF1形成的病灶。底部面板，放大。（D）共聚焦分析转染MRPP3-MYC、GRSF1-HA和mitoECFP的HeLa细胞，并用抗MYC和抗HA抗体进行免疫标记。箭头，线粒体中GRSF1形成的病灶。底部面板，放大。

图5
GRSF1缺失导致线粒体RNA加工异常（A）线粒体基因组的线性表示。红色，rRNA；绿色，ORF；蓝色，tRNA。RNA19对应于多顺反子16S rRNA−tRNA^{亮氨酸（UUA/G）}−*MTND1型*RNA。RNA14对应双顺反子*MTATP8公司*-*MTATP6*RNA。HSP，重量级启动子。LSP，轻链启动子。（B）使用针对线粒体tRNA的探针对携带空载体（pLKO）或GRSF1 RNAi2的慢病毒处理的143B细胞的tRNA连接进行Northern blot分析^{酸碱度e（电子）}，tRNA^瓦尔和tRNA^遇见箭头表示RNA前体。短期和长期对应不同的风险敞口。（C） RNA19（16S rRNA−tRNA）的Northern blot分析^{亮氨酸（UUA/G）}−*MTND1型*)在携带空载体（pLKO）或GRSF1 RNAi2的慢病毒处理的143B细胞中，使用针对16S rRNA、tRNA的探针^{亮氨酸（UUA/G）}，或*MTND1型*箭头表示RNA19。短和长对应于不同的曝光时间。（D）使用针对RNA14的探针对携带空载体（pLKO）或GRSF1 RNAi2的慢病毒处理的143B细胞中tRNA-less RNA连接的Northern blot分析(*MTATP8公司*−*MTATP6*),*MTCO3公司*,*第5个月*、和*第6个月*箭头和数字表示RNA前体。短时间和长时间对应不同的曝光时间。（E）使用针对微管蛋白的探针对携带空载体（pLKO）或GRSF1 RNAi2的慢病毒处理的143B细胞进行Northern blot分析。注意，探针识别出两种亚型微管蛋白。短和长对应不同的曝光时间。（F）磷光成像仪定量（B）–（D）。*MTND6型*由于其扩散模式，未进行量化。数据归一化为微管蛋白，显示为平均值±SEM（n≥3）。（G）前体和成熟RNA之间的比率（如适用）。*MTND6型*由于其扩散模式，未进行量化。数据显示为平均值±SEM（n≥3）。

图6
转录抑制诱导线粒体RNA颗粒消失（A）工作模型：我们假设新生线粒体编码的前体RNA收敛到线粒体RNA颗粒（MRG）。MRG包含新生RNA、GRSF1和RNase P。用放线菌素D（ActD）或溴化乙锭（EtBr）抑制线粒体转录，以及用RNAi抑制GRSF1或MRPP1的RNA加工，预计会影响MRG的形成。线粒体DNA。（B）使用针对tRNA的探针对143B细胞用3μM ActD处理0、60或120分钟进行Northern blot分析^苯丙氨酸，tRNA^瓦尔,*MTCO3公司*和微管蛋白。箭头，RNA前体。注意，探针识别出两种微管蛋白亚型。短时间和长时间对应不同的曝光时间。（C）磷光成像仪量化（B）后的RNA前体/成熟比率。数据显示为平均值±SEM（n=3）。（D）共聚焦分析转染GRSF1-HA并用3μM ActD、3μg/ml EtBr处理120分钟的HeLa细胞。使用抗HA和抗Tom20抗体进行免疫标记。箭头，MRG。

图7
MRG中RNA释放的动力学取决于GRSF1（A）在BrU脉冲60分钟和尿苷追踪0或90分钟后，对感染pLKO或GRSF1 RNAi2慢病毒的143B进行共聚焦分析。在这两种条件下，用于整个分析的参数是相同的。请注意，设置阈值是为了只显示BrU焦点。（B） pLKO或GRSF1 RNAi2感染细胞内源性GRSF1和Tom20的共聚焦分析。用于整个分析的参数在两种条件下都是相同的。（C）在用携带慢病毒的pLKO或GRSF1 RNAi2感染的143B细胞中，在BrU脉冲60分钟和用尿苷追逐长达180分钟后具有BrU病灶的细胞数量。使用宽视野显微镜对细胞进行计数。数据显示为平均值±SEM（n=3）。（D）混合对照（绿色）和GRSF1 RNAi2细胞BrU脉冲追踪的共焦分析。对照143B细胞感染了携带空pLKO载体的慢病毒和携带GFP基因的慢病毒（pLKO+GFP），而GRSF1缺失的细胞感染了表达GRSF1 RNAi2的慢病毒。所有对照细胞均表达GFP（数据未显示）。将两个细胞群混合，用嘌呤霉素筛选24小时，以消除那些不会被慢病毒感染的细胞，并在用尿苷追踪之前用BrU培养60分钟。用抗BrU和抗Tom20抗体对细胞进行免疫染色。

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