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.2013年3月1日；3（3）：e103。
doi:10.1038/bcj.2013.2。

奈非那韦增强硼替佐米对骨髓瘤细胞蛋白酶体的抑制，并克服硼替佐米布和卡非佐米布耐药

M克劳斯 1, J Bader（巴德）, H Overkleeft公司, C德莱森
附属公司

奈非那韦增强硼替佐米对骨髓瘤细胞蛋白酶体的抑制，并克服硼替佐米布和卡非佐米布耐药

M克劳斯等。 血癌J. .

摘要

HIV蛋白酶抑制剂（HIV-PI）是治疗HIV的口服药物。HIV-PI通过诱导ER应激、抑制磷酸化AKT（p-AKT）和蛋白酶体而具有抗肿瘤活性，表明其具有抗骨髓瘤活性。我们描述了所有批准的HIV-PI对骨髓瘤细胞的作用。在体外使用骨髓瘤细胞比较HIV-PI的细胞毒性、蛋白酶体活性、ER应激诱导和AKT磷酸化。Nelfinavir是一种HIV-PI，对原发性骨髓瘤细胞具有最高的细胞毒活性，IC50接近治疗药物血浓度（8-14μM），与硼替佐米敏感性无关。在药物浓度<40μM时，只有奈非那韦原位抑制细胞内蛋白酶体活性。利托那韦、萨奎那韦和洛匹那韦抑制p-AKT的作用与奈非那韦相当，并且与硼替佐米对硼替佐米特敏感细胞具有类似的协同细胞毒性。奈非那韦与硼替佐米/卡非佐米具有良好的协同作用，尤其是对硼替佐米布/卡非佐米耐药骨髓瘤细胞具有协同作用。它不仅抑制蛋白酶体β1/β5活性位点，类似于硼替佐米/卡非佐米，而且还抑制硼替佐米非靶向的β2蛋白酶体活性。已知对β2蛋白酶体活性的额外抑制可使细胞对硼替佐米和卡非佐米敏感。奈非那韦具有独特的蛋白酶体抑制活性，特别是对完整骨髓瘤细胞中硼替佐米/卡非佐米b不敏感胰蛋白酶体（β2）的活性，并且在体外对硼替佐米布/卡非佐米b耐药骨髓瘤细胞具有活性。

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数字

图1
图1
不同HIV-PI对骨髓瘤细胞系和原代细胞的细胞毒性作用。(一)骨髓瘤细胞系（RPMI8226，AMO-1）以及硼替佐米抗性骨髓瘤细胞（AMO-1a，与它们对硼替佐米敏感的野生型（wt）亲代细胞系AMO-1相比）与所有九种经批准的HIV-PI（Am，amprenavir；At，atazanavir；D，达鲁那韦；I，indinavir；T，替普那韦；L，洛匹那韦；N，奈非那韦；R、 利托那韦；S、 saquinavir）和通过二甲基噻唑-二苯基四唑试验测定的细胞活力。(b条)从先前含硼替佐米治疗失败的患者分离的骨髓瘤细胞用硼替佐米布20进行激发 nℳ在体外通过二甲基噻唑-二苯基四唑试验评估细胞活力。(c（c）)患者的原发性骨髓瘤细胞(n个=4），以及正常PBMC(n个=4），以及来自健康干细胞供体的CD138浆细胞与浓度增加的奈非那韦和IC孵育50和IC80通过二甲基噻唑-二苯基四唑试验进行评估。*根据学生的t吨-测试。(d日)上述原发性骨髓瘤细胞样本和PBMC与浓度增加的洛匹那韦（L）、奈非那韦（N）、利托那韦（R）和沙奎那韦（S）孵育，并通过二甲基噻唑-二苯基四唑试验测定细胞活力。
图2
图2
奈非那韦单独或与硼替佐米联合使用对蛋白酶体的抑制。(一)将RPMI8226骨髓瘤细胞与洛匹那韦（L）、奈非那韦（N）、利托那韦（R）或沙奎那韦（S）在指定浓度下孵育，并使用MV151共价亲和标记程序将完整细胞中的活性蛋白酶体亚基与未经处理的对照细胞样品进行定量比较（左图）。右图：未处理的细胞（0）也与硼替佐米（B）或奈非那韦（N）处理的细胞或硼替佐米加奈非那韦联合处理的细胞进行比较（B+N，20 nℳ和20 μℳ；右侧面板）。用泛蛋白组抑制剂4-羟基-5-碘-3-硝基苯乙酰基-Leu-Leu-乙烯基砜（NLVS）处理的细胞50 μℳ被用作完全抑制蛋白酶体活性的比较。条形图显示了β1/β5活性或β2活性的特定荧光信号相对于未处理对照样品的定量变化。(b、 c（c）)AMO-1和U266（2B）以及硼替佐米耐药的AMO-1A（2C）骨髓瘤细胞与硼替佐米特（B:5）培养 AMO-1，10 nM nℳ用于U266(c（c）)5和10 nℳ对于AMO-1A），奈非那韦（n）高达40 μℳ或奈非那韦20mM+硼替佐米（B+N）与细胞内蛋白酶体活性的组合使用亲和探针MV151进行评估。条形图表示蛋白酶体亚单位特异性（β1/β5 vsβ2）荧光信号与未处理对照组（0）相比的相对变化。
图3
图3
奈非那韦对骨髓瘤细胞UPR的分子效应。用western blot评估图2a中的骨髓瘤细胞样本经奈非那韦（N）、利托那韦（R）、沙奎那韦（S）或洛匹那韦（L）处理后的BIP、CHOP、p-IRE1α、Akt、p-Akt、p27和多泛素化蛋白的表达。
图4
图4
奈非那韦联合硼替佐米对骨髓瘤细胞的分子效应。RPMI8226骨髓瘤细胞暴露于硼替佐米（bor，20 nℳ）和奈非那韦（nelfinavir，20 μℳ）单独或组合在体外用衣霉素处理的细胞（TM，6 mg/ml）作为UPR诱导的阳性对照。Western blot法比较UPR激活程度及其转化为凋亡（BiP、PDI、CHOP、裂解PARP、左上方）、蛋白酶体抑制的细胞转化（p27、p-IκBα、多泛素化蛋白）、，三种主要UPR诱导信号的激活（p-elF2α，裂解活性ATF6，p-IRE1α表达；右上），caspase 4，8和9的UPR依赖性激活（左下），以及奈非那韦+硼替佐米对有丝分裂原活化蛋白激酶途径（p-ERK，p-JNK，p-p38，p-c-JUN，右下）的影响。
图5
图5
HIV-PI与硼替佐米和卡非佐米的协同细胞毒性。(一)AMO-1细胞与相应的HIV-PI（0–20 μℳ）结合硼替佐米0-5 nM（上面板），或与卡菲尔佐米布（0-5）联合使用 nM，下表），并通过二甲基噻唑-二苯基四唑试验评估细胞活力。(b条)奈非那韦、洛匹那韦、沙奎那韦、利托那韦与硼替佐米的协同细胞毒作用(一与其他HIV-PI（补充图3）相比，上面板）通过等高线图（虚线下方的符号在统计上表示协同作用）进行了统计确认。
图6
图6
奈非那韦和硼替佐米对硼替佐米布/卡非佐米布耐药骨髓瘤细胞的协同作用。(一)右图：硼替佐米耐药AMO-1a细胞与硼替佐米特（Bz）20共培养 nℳ和HIV-PI显示（洛匹那韦；n:nelfinavir；R:ritonavir；S:saquinavir，20 μℳ每个）单独或联合，并测量细胞毒性。右侧面板：AMO-1或AMO-1a细胞与指定浓度的卡非佐米布（Cf，10=10 nM，20=20 nℳ）单独或与奈非那韦（n）、利托那韦（R）、洛匹那韦（L）或沙奎那韦（S）联合使用（20 μℳ每个），并通过二甲基噻唑-二苯基四唑试验评估活细胞比例。(b条)上图：来自硼替佐米耐药或敏感骨髓瘤细胞样本（MMsens，MMres）的原代细胞样本与浓度增加的奈非那韦（0-10）混合 μℳ）结合硼替佐米浓度增加（0-高达20 nℳ，如图所示），并评估细胞活力。下面板：奈非那韦和硼替佐米对硼替佐米特耐药的原发性骨髓瘤细胞样本的协同细胞毒性作用通过等博图进行了统计证实（虚线下方的符号表示协同作用）。
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