Mitochondrial SIRT4-type proteins in Caenorhabditis elegans and mammals interact with pyruvate carboxylase and other acetylated biotin-dependent carboxylases

doi:10.1016/j.mito.2013.02.002

.2013年11月；13(6):705-20.

doi:10.1016/j.mito.2013年2月2日。 Epub 2013年2月21日。

秀丽隐杆线虫和哺乳动物的线粒体SIRT4型蛋白与丙酮酸羧化酶和其他乙酰化生物素依赖羧化酶类相互作用

玛蒂娜·沃思¹, 萨米尔·卡拉卡, 德克·温泽尔, 林浩（Linh Ho）, 丹尼尔·蒂什科夫, 大卫·B·伦巴第, 埃里克·威尔第, 亨宁·厄劳布（Henning Urlaub）, 莫妮卡·杰德鲁西克·博德, 沃尔夫冈·菲施勒

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采购管理信息： 23438705
PMCID公司：项目经理3744624
内政部： 10.1016/j.mito.2013.02.002

秀丽隐杆线虫和哺乳动物的线粒体SIRT4型蛋白与丙酮酸羧化酶和其他乙酰化生物素依赖羧化酶类相互作用

玛蒂娜·沃思等。线粒体. 2013年11月.

.2013年11月；13(6):705-20.

doi:10.1016/j.mito.2013年2月2日。 Epub 2013年2月21日。

作者

附属

¹德国哥廷根马克斯·普朗克生物物理化学研究所染色质生物化学实验室，37077。

采购管理信息： 23438705
PMCID公司：项目经理3744624
内政部： 10.1016/j.mito.2013.02.002

摘要

SIRT4的生物和酶功能基本上没有特征。我们发现SIRT4的秀丽隐杆线虫SIR-2.2和SIR-2.3同源基因普遍表达，也定位于线粒体和氧化应激期间的功能。此外，我们确定了与线粒体生物素依赖性羧化酶（PC、PCC、MCCC）的保守相互作用，这些酶是补体和酮体形成的关键酶。羧化酶在多个赖氨酸残基上被乙酰化，对mPC的详细分析表明，其中一个残基K748ac可能调节酶的活性。然而，在功能性SIRT4过表达或缺失时，不能检测到mPC乙酰化水平和酶活性的变化。

关键词：生物素依赖性羧化酶；秀丽线虫；蛋白质乙酰化；丙酮酸羧化酶；SIRT4；Sirtuins公司。

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数字

**图1。*秀丽线虫*SIR-2.2和SIR-2.3是线粒体蛋白质**
（A）和（B）代表性荧光共焦图像*sir-2.2:：gfp*成人头部和性腺中SIR-2.2:：GFP表达的转基因蠕虫*秀丽线虫*（C）和（D）SIR-2.3:：GFP在成虫头部和性腺中的表达和定位。箭头指向头部不明细胞。（E） SIR-2.2:：GFP和SIR-2.3:：mCherry在双转基因小鼠头部的表达和定位*sir-2.2:：gfp*;*sir-2.3:：麦克里*蠕虫。比例尺表示50µm的放大倍数。（F）使用抗SIR-2.2抗体对野生型N2蠕虫进行免疫金标记。（G） ●●●●。代表性冷冻切片*sir-2.3:：gfp*抗GFP抗体染色的转基因蠕虫。用蛋白A结合的金珠（10 nm）观察免疫复合物。高密度黑点表明SIR-2.2和SIR-2.3定位于线粒体。比例尺表示放大200 nm。（H）野生型N2蠕虫和*sir-2.3:：gfp*转基因蠕虫被均质并通过差速离心进行亚细胞分离。使用所示抗体，通过SDS-PAGE和Western blotting分析核后上清液（PNS）、线粒体颗粒（MP）和线粒体后上清（PMS）的等蛋白量。

**图2。*秀丽线虫*SIR-2.2和/或SIR-2.3的过度表达或缺陷表明对氧化应激的敏感性增加**
（A）在含有百草枯的RNAi供料板上，计算出在24.5°C下生长的不同蠕虫的平均寿命（向板上添加200µl 250 mM百草枯溶液）。野生型（N2），蠕虫过度表达SIR-2.2(*sir-2.2:：gfp*)或SIR-2.3(*sir-2.3:：gfp*)，中的蠕虫突变*sir-2.2（sir-2.2（tm2648））*或*sir-2.3（sir-2.3，ok444）*被喂饱了*大肠杆菌HT115*(*数据元素3*)包含空L4440矢量（控制进给）。蠕虫突变体*sir-2.2（sir-2.2（tm2648））*被喂饱了*大肠杆菌HT115*(*数据元素3*)包含编码的质粒*sir-2.3标准*(*sir-2.3标准*喂食）和蠕虫突变*sir-2.2（sir-2.2（tm2648））*被喂饱了*大肠杆菌HT115*(*数据元素3*)包含编码的质粒*sir-2.2标准*(*sir-2.2标准*喂料）。每个菌株至少进行3次试验。误差条显示平均值的标准误差（S.E.M.）；星号表示野生型（N2）蠕虫的平均寿命存在显著差异（p值<0.001）；使用标准Student t检验计算p值；n：分析的蠕虫数量。（B）（A）中分析的蠕虫菌株的平均存活曲线。（C） [NAD分析⁺]/野生型N2全虫裂解物中的[NADH]水平，*sir-2.2:：gfp*和*sir-2.3:：gfp*过度表达的蠕虫。误差条表示平均值的标准误差；***与使用Student’st吨-测试。

**图3。线粒体生物素羧化酶作为SIR-2.2相互作用因子的鉴定**
（A）用于识别SIR-2.2交互伙伴的策略的示意图概述。在内源性启动子的控制下，产生了一个稳定的表达SIR-2.2并带有C末端Strep-GFP-tag的整合转基因蠕虫菌株，并用于提取物制备。GFP标记的SIR-2.2用抗GFP特异性抗体或来自总蠕虫提取物或线粒体蠕虫提取物的抗SIR-2.2特异性抗体免疫沉淀。分离的蛋白质进行SDS-PAGE并通过质谱分析。（B）的蛋白质序列线虫D2023.2（PYC-1）。（C）的蛋白质序列*秀丽线虫*F27D9.5（PCCA-1）。（D） F32B6.2（MCCC-1）的蛋白质序列。质谱分析确定的肽在蛋白质序列上突出显示。显示了总序列覆盖范围。

**图4。哺乳动物SIRT4与线粒体生物素依赖性羧化酶特异性相互作用**
（A）将编码SIR-2.2-GFP、SIR-2.3-GFP或GFP的表达载体与FLAG标记的表达载体共转染HEK293细胞*秀丽线虫*PCCA-1、MCCC-1或PYC-1或小鼠ACDH-3或HP1β。用GFP-TrapA免疫沉淀GFP标记蛋白，并使用抗FLAG、抗SIR-2.2和抗GFP抗体通过SDS-PAGE和Western blotting进行分析。一：投入（2%）；S：免疫沉淀后上清液（2%）；IP：免疫沉淀物质。（B）与（A）中的分析类似，但使用编码小鼠SIRT4-GFP、PCCA-FLAG、MCCC1-FLAG和PC-FLAG以及GFP的载体。**（C）**人SIRT3、SIRT4、SIRT5和CDYL1c的表达载体（MYC-tagged）与编码小鼠PC、MCCC1、HP1βPCCA的表达载体共同转染HEK293细胞。用抗FLAG抗体免疫沉淀蛋白质，并用抗MYC和抗FLAG的抗体进行Western blotting分析（顶部）。用抗MYC抗体直接在Western blotting中分析细胞提取物（输入），以确定每个实验中标记蛋白的表达水平（底部）。

**图5。PC、PCCA和MCCC1的生物素羧化酶结构域特异性结合SIRT4**
（A）线粒体生物素羧化酶结构域组织的示意图。所有三种蛋白质都具有高度保守的N-末端生物素羧化酶结构域（BC）和C-末端生物素羧基载体蛋白结构域（BCCP）。括号表示为映射与SIRT4交互的区域而生成的删除构造。突变蛋白的结构域边界由氨基酸位置指示。分析与PC（B）、PCCA（C）和MCCC1（D）的相互作用。对于共免疫沉淀实验，指示的FLAG标记的生物素依赖性羧化酶的缺失构建体与人SIRT4-MYC一起在HEK293细胞中瞬时表达。将等量的免疫沉淀MYC标记的SIRT4加载到SDS-PAGE凝胶上，并使用抗FLAG和抗MYC抗体进行Western blotting分析（顶部）。用抗FLAG抗体直接在Western blotting中分析细胞提取物（输入），以确定每个实验中标记蛋白的表达水平（底部）。右侧显示了FLAG标记蛋白和抗体重链和轻链的运行位置。

**图6。PC乙酰化与SIRT4的相关性分析**
（A）将编码FLAG标记mPC、mPCCA和mMCCC1的表达载体或空载体（载体）转染HEK293细胞。用抗FLAG抗体从总细胞提取物中免疫沉淀蛋白质。显示了使用抗乙酰赖氨酸特异性抗体（AcK）和抗FLAG抗体对回收材料进行的蛋白质印迹分析。（B）不同mPC-FLAG突变体在HEK293T细胞中过度表达的酶活性。使用柠檬酸合成酶偶联分析测定总细胞裂解物的丙酮酸羧化酶活性。丙酮酸通过PC的羧基化与草酰乙酸通过柠檬酸合成酶转化为柠檬酸偶联。通过测量405nm处吸光度的增加来记录生成的CoASH对DTNB的减少。根据mPC蛋白相对量的最大反应速度（ΔA/min）计算活性（通过Western blot分析定量）。相对活性（归一化为wt-mPC）表示为至少三个独立实验的方法。误差条表示标准偏差。（C）使用SILAC对在诱导控制下单独或与SIRT4-MYC一起表达mPC-FLAG的HEK293细胞进行代谢标记。在抗FLAG免疫沉淀后，将从mPC-FLAG（在轻培养基中标记）和mPC-FLA、SIRT4-MYC（在重培养基中标识）细胞（左侧面板）或mPC-FFLAG（在轻型培养基中标签）和mPC-FLAG细胞（在重介质中标记）（右侧面板）中回收的材料混合，在SDS-PAGE上运行，并进行定量质谱分析。对从一个细胞标记实验的mPC中获得的经鉴定的乙酰化（红色）和非乙酰化（灰色）肽的标准化比率进行了印迹。

**图7。SIRT4不影响mPC的稳定性或酶活性**
（A） mPC蛋白稳定性分析。用1µM TSA和10 mM NAM隔夜处理稳定诱导mPC-FLAG HEK293细胞或稳定过度表达人SIRT3-MYC或SIRT4-MYC的细胞。分别用环己酰亚胺（20μg/ml）和MG132（20μM）抑制蛋白质合成和蛋白酶体蛋白质降解6 h。用所示抗体通过Western blot分析细胞裂解物。**（B）**稳定诱导mPCFLAG HEK293细胞中的丙酮酸羧化酶活性，单独或稳定过度表达人SIRT3-MYC或SIRT4-MYC。对于葡萄糖饥饿（右图），细胞在无葡萄糖培养基中培养过夜。相关活动（在没有SIRT3或SIRT4的情况下归一化为mPC-FLAG）表示为至少三个实验的方法。误差线表示标准偏差。**（C）**野生型和SIRT4肝裂解物中mPC的酶活性^−/−小鼠喂食（左）或禁食24小时（右）。相对活性（标准化为野生型）表示为每种条件下使用两只（喂食）至三只（禁食）小鼠进行的至少三个实验的平均值。误差线表示标准偏差。

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