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.2013年4月1日；304（7）：R553-65。
doi:10.1152/ajpregu.00249.2012。 Epub 2013年2月13日。

磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶过度表达逆转1型糖尿病心脏线粒体蛋白质组丢失

沃尔特·巴斯勒 1, 埃琳·达布科夫斯基, 拉贾加纳帕提·贾甘纳森, 达伦德拉·塔帕, 科迪·尼科尔斯, 丹妮尔·谢泼德, 塔拉·克罗斯顿, 马修·鲍威尔, 信托T Razunguzwa, 萨拉·刘易斯, 大卫·M·施奈尔, 约翰·霍兰德
附属公司

磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶过度表达逆转1型糖尿病心脏线粒体蛋白质组丢失

沃尔特·巴斯勒等。 美国生理学杂志Regul Integr Comp Physiol. .

摘要

线粒体功能障碍是糖尿病心肌病的病因之一。此前，我们观察到糖尿病心脏纤维间线粒体（IFM）内线粒体膜（IMM）和基质中的蛋白质组减量与线粒体蛋白输入功能障碍相关。本研究的目的是确定线粒体磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶4（mPHGPx）的过度表达是否能够逆转蛋白质组的改变、功能失调的蛋白质输入，最终，线粒体功能障碍与糖尿病心脏相关。通过多次低剂量链脲佐菌素注射使MPHGPx转基因小鼠和对照小鼠成为糖尿病小鼠，并在高血糖5周后进行检测。在高血糖发作五周后，对心脏收缩功能的体内分析显示，糖尿病心脏的射血分数和缩短分数降低，而mPHGPx的过度表达可以逆转这一现象。MPHGPx过表达增加了糖尿病MPHGPx IFM的电子传递链功能，同时减少了过氧化氢的生成和脂质过氧化。MPHGPx过表达减少了糖尿病IFM中观察到的蛋白质组丢失。翻译后修饰，包括氧化和脱酰胺，在糖尿病IFM中mPHGPx过度表达减弱。糖尿病IFM的线粒体蛋白输入功能障碍可通过与蛋白输入成分保存相关的mPHGPx过表达逆转。灵巧性途径分析表明，mPHGPx过度表达可保护糖尿病IFM中受影响最大的氧化磷酸化、三羧酸循环和脂肪酸氧化过程。保存的特定线粒体网络包括复合物I和II、线粒体超微结构和线粒体蛋白输入。这些结果表明，mPHGPx过表达可以保存线粒体蛋白质组，并为糖尿病心脏提供心脏保护益处。

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数字

图1。
图1。
线粒体磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶4（mPHGPx）转基因小鼠的筛选。A类：mPHGPx转基因（mPHGPx）和野生型对照（WT）小鼠心脏单个线粒体亚群中mPHGPxprotein表达的代表性Western blot分析。Pon，Ponceau染色负荷控制。B类：线粒体亚室mPHGPx蛋白表达的代表性Western blot分析。对线粒体亚室进行分离并检测mPHGPx的存在。用亚细胞室特异性蛋白对单个组分进行检测，以确定亚分馏过程、线粒体外膜（OMM）（线粒体裂变1蛋白，FIS1）、内膜间隙（IMS）（第二线粒体衍生半胱氨酸天冬氨酸酶激活物，SMAC）、线粒体内膜（IMM）的纯度（腺嘌呤核苷酸转位酶，ANT）和基质（亲环素D）。
图2。
图2。
线粒体呼吸。状态3和状态4以谷氨酸盐为底物在肌下膜（SSM）中的呼吸速率(A类)和纤维间线粒体（IFM）(B类). 状态3和状态4呼吸速率是在存在底物谷氨酸盐的情况下测定的，状态3呼吸是在添加ADP的情况下检测的。数值为±SE*P（P）糖尿病组与所有组相比均<0.05。
图3。
图3。
H（H）2O（运行）2生产。H（H）2O（运行）2SSM生产(A类)和IFM(B类)使用荧光指示剂amplex红在辣根过氧化物酶存在下的氧化进行测定。H（H）2O（运行）2以谷氨酸盐为底物在线粒体中启动生产。通过添加已知量的H获得标准曲线2O（运行）2在存在底物amplex red和辣根过氧化物酶的情况下，将其转移到分析培养基中。最终值以pmol/mg蛋白质计算。数值表示为平均值±SE*P（P）糖尿病组与所有组相比均<0.05。
图4。
图4。
脂质过氧化副产物。SSM中评估了脂质的氧化损伤(A类)和IFM(B类)通过使用比色测定法测量脂质过氧化副产物丙二醛（MDA）和4-羟基烯醛（4-HAE），并与已知的4-HAE和MDA浓度的标准曲线进行比较。脂质过氧化副产物的值表示为平均值±SE*P（P）糖尿病组与所有组相比均<0.05。
图5。
图5。
糖尿病和mPHPGx糖尿病IFM的蛋白质组学改变。A类：仅在糖尿病IFM中蛋白质总数减少(左边)，蛋白质在糖尿病IFM中减少，在mPHGPx糖尿病IFM内保留(中间的)和蛋白质仅在mPHGPx糖尿病IFM中增加(正确的).B类：糖尿病IFM中丢失的蛋白质含量的近似百分比分解，随后保存在mPHGPx糖尿病IFM。C类：使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）软件确定的线粒体典型通路受到糖尿病损伤的负面影响最大，随后通过mPHGPx过度表达恢复。糖尿病对氧化磷酸化、三羧酸循环（柠檬酸循环）、脂肪酸代谢和脂肪酸伸长产生负面影响（浅灰色）。相反，在mPHGPx过度表达的糖尿病IFM中，这些途径以及丙酮酸代谢被保留（深灰色阴影）。糖尿病。，糖尿病；Ctrl，control。
图6。
图6。
线粒体蛋白质网络。使用IPA软件鉴定线粒体蛋白质组网络对糖尿病IFM产生负面影响，并保存在mPHGPx糖尿病IFM中。六个网络，包括电子传递链（ETC）复合物I和II，H2O（运行）2生产、结构、ATP-敏感K+对通道和线粒体蛋白导入进行了鉴定。线粒体蛋白质输入网络是连接所有其他网络的中心节点。绿色表示保存在mPHGPx糖尿病IFM中的蛋白质。红色表示mPHGPx-糖尿病IFM的蛋白质正增强。白色表示糖尿病未改变的蛋白质，但它们是各自网络的一部分。
图7。
图7。
线粒体蛋白质输入。1型糖尿病和mPHGPx过度表达对IFM中MitoGFP1输入的影响。A类：来自IFM蛋白导入分析的代表性Western blots。Ponceau（Pon）染色证实了蛋白质负荷的控制。B类：对照组糖尿病、mPHGPx和mPHGPx-糖尿病患者线粒体蛋白输入的图形表示。通过密度测定法测定导入的MitoGFP1的相对量。虚线表示控制级别。进口效率基于1分钟和2分钟时间点的百分比控制。然后对两个时间点百分比进行平均，以显示总进口效率。数值表示为平均值±SE*P（P）与所有组相比，糖尿病组<0.05。N个=每组5人。
图8。
图8。
线粒体蛋白质进口成分。蛋白质输入成分的免疫印迹分析。线粒体蛋白质输入的关键蛋白用免疫印迹法进行评估。Tom20的典型Western blot和密度分析(A类)，计时50(B类)，mtHsp70(C类)和Tim23(D类)来自对照组、mPHGPx、糖尿病组和mPHGPx-糖尿病组。CoxIV染色证实了蛋白质负荷的控制。数值表示为平均值±SE*P（P）mPHGPx糖尿病vs.糖尿病<0.05#P（P）对照组与糖尿病组<0.05。N个=每组4人。
图9。
图9。
mtHsp70蛋白复合。1型糖尿病和mPHGPx过度表达对来自对照组、糖尿病组、mPHGPx和mPHGPx糖尿病组的分离IFM中mtHsp70-Tim44复合物的影响。IFM进行BN-PAGE，并检测mtHSP70的蛋白复合物。A类：mtHsp70和Tim44的络合物存在于119 kDa。B类：通过密度测定法分析mtHsp70含量*P（P）与所有组相比，糖尿病组<0.05。N个=每组4人。
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