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.2013年5月；11(5):482-93.
doi:10.1158/1541-7786.MCR-12-0520。 Epub 2013年2月5日。

WNT7B诱导的非经典途径在晚期前列腺癌中的作用

大理正 1, 基思·F·戴克, 周天华, 陈建全, 宗泰旗, 凯瑟琳·雅各布斯, 凯瑟琳·魏尔巴彻（Katherine N Weilbaecher）, 伊娃·科里, 繁新龙, 李佳
附属公司

WNT7B诱导的非经典途径在晚期前列腺癌中的作用

大理正等。 摩尔癌症研究. 2013年5月.

摘要

晚期前列腺癌的特点是不可治愈的去势抵抗进展和成骨细胞骨转移。虽然雄激素剥夺治疗仍然是晚期前列腺癌的主要治疗方法，但不可避免地会产生耐药性。重要的是，越来越多的证据表明，尽管雄激素缺乏，雄激素受体（AR）信号仍在晚期前列腺癌的生长中发挥关键作用。虽然对晚期前列腺癌中异常AR激活的机制进行了广泛研究，但参与去势抵抗进展的下游AR靶基因在很大程度上尚不清楚。在这里，我们确定WNT7B是在去势耐受性前列腺癌（CRPC）细胞中高度表达的直接AR靶基因。我们的结果表明，WNT7B的表达对前列腺癌细胞的生长是必要的，并且在雄激素缺乏的条件下这种作用会增强。进一步分析表明，WNT7B可能通过激活蛋白激酶C同工酶促进CRPC细胞的雄激素依赖性生长。我们的结果还表明，前列腺癌产生的WNT7B通过直接的细胞-细胞相互作用在体外诱导成骨细胞分化，WNT7B在人类前列腺癌异种移植物中上调，在骨中生长时会引起成骨反应。综上所述，这些结果表明，AR调节的WNT7B信号对CRPC的生长和晚期前列腺癌成骨细胞骨反应特征的形成至关重要。

PubMed免责声明

利益冲突声明

潜在利益冲突的披露：未披露潜在的利益冲突。

数字

图1
图1
WNT7B是前列腺癌细胞中的AR靶基因。A、 qRT-PCR结果显示WNT7B在LNCaP和C4-2B细胞中表达。细胞在含有5%CSS的RPMI-1640培养基中生长3天，然后用乙醇或10 nmol/L DHT处理16小时。B、 Western blot分析显示WNT7B蛋白水平在与（A）相同的条件下。C、 ChIP-seq结果显示WNT7B型LNCaP和C4-2B细胞中的基因座。D、 进行ChIP-qPCR分析以确认ChIP-seq结果。前列腺特异性抗原(PSA公司)增强子位点作为阳性对照。阴性对照区的AR占用率定义为1。E、 C4-2B细胞在含有5%CSS的RPMI-1640培养基中培养2天，然后进行AR siRNA转染。在AR siRNA转染后3天进行WNT7B mRNA水平的qRT-PCR分析。通过Western blot分析平行检测AR蛋白水平（插图）。*，对< 0.05; **,对<0.01，由双尾学生确定t吨测试。GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
图2
图2
WNT7B是雄激素依赖性和CRPC细胞生长所必需的。A、 WNT7B siRNA转染3天后，通过Western blot分析检测WNT7B蛋白水平。B、 在存在或不存在10 nmol/L DHT的情况下，WNT7B siRNA转染后3天和5天，使用CCK8检测LNCaP和C4-2B细胞增殖。C、 在存在或不存在10 nmol/L DHT的情况下，WNT7B siRNA转染3天后，LNCaP和C4-2B细胞的凋亡检测显示caspase-3和-7活性。结果显示为两个独立实验的平均值±SD。D、 TUNEL分析在与（C）相同的条件下进行。共拍摄了10个田地。计算每个区域的细胞总数和TUNEL阳性细胞数，并计算凋亡细胞百分比。E、 Western blot分析证实WNT7B过表达稳定前列腺癌细胞系。F、 在CCK8分析之前，在存在或不存在10 nmol/L DHT的情况下培养过度表达WNT7B或载体对照的LNCaP和C4-2B细胞5天。G、 在软琼脂集落形成试验中检测具有稳定WNT7B敲除（shWNT7B-1和-2）或对照敲除（sh LacZ）的C4-2B细胞。在含有10%FBS的RPMI-1640培养基中进行检测。菌落数表示为3个独立微孔的平均±SD。该实验至少进行了3次独立的实验。H、 WNT7B-过表达或载体控制C4-2B细胞用于软琼脂集落形成分析，如（G）所示。*，对< 0.05; **,对< 0.01; ***,对< 0.001; NS，不显著，由双尾学生确定t吨测试。
图3
图3
WNT7B以β-连环蛋白非依赖性方式促进雄激素依赖性C4-2B细胞生长。A、 Western blot分析结果显示，在敲除WNT7B（siNS1 vs.siWNT7B）或在没有雄激素的情况下过度表达WNT7A（Vector vs.WNT7C）后，C4-2B细胞中的β-连环蛋白、磷酸化β-连环素（p-β-catenin。B、 瞬时转染TOPFlash和FOPFalsh报告基因后，在HCT116和C4-2B（有或没有WNT7B过度表达）细胞中进行荧光素酶分析。用或不用重组WNT3A处理细胞。C、 在没有DHT的情况下，在β-连环蛋白siRNA（siβ-catenin）转染后3天和5天，使用CCK8检测C4-2B细胞增殖。使用两种不同的siβ-catenin转染C4-2B细胞（插图）3天后，通过Western blot分析检测β-catentin蛋白水平。
图4
图4
WNT7B通过PKC信号通路促进雄激素依赖性C4-2B细胞生长。在不含雄激素的情况下，PKCα（A）或PKCδ（B）RNA干扰C4-2B细胞3天后，通过Western blot分析检测A和B、PKCα、PKCδ、磷酸化标记物（p-MARCKS）和标记物蛋白水平。在不含雄激素的情况下，转染siPKCα（C）、siPKCδ（D）或siMARCKS（E）后3天和5天，使用CCK8检测C–E、C4-2B细胞增殖。MARCKS RNA干扰C4-2B细胞（插图）3天后，通过Western blot分析检测MARCKS-蛋白水平。***，对<0.001，由双尾学生确定的非特异性siRNA和基因特异性siRNA之间t吨测试。
图5
图5
C4-2B产生的WNT7B促进成骨细胞分化。A、 用WNT7B siRNA（siWNT7B）或非特异性siRNA（siNS1）转染C4-2B细胞。24小时后，C4-2B细胞与ST2细胞在成骨培养基中共培养。为了测定ST2细胞的成骨细胞活性，在第7天进行碱性磷酸酶染色，并在第21天进行钙沉积的von Kossa染色（左）。第7天（右侧）用qRT-PCR检测小鼠ALP和BSP mRNA水平。B、 WNT7B过度表达的C4-2B细胞或载体控制细胞与ST2细胞在成骨培养基中共同培养。进行与（A）中相同的分析。C、 WNT7B过度表达的C4-2B细胞或载体控制细胞与C3H10T1/2细胞在成骨培养基中共同培养。进行与（A）中相同的分析。*，对< 0.05; **,对<0.01，由双尾学生确定t吨测试。
图6
图6
WNT7B在前列腺癌异种移植组织中过度表达，导致成骨细胞损伤。通过微阵列研究分析前列腺癌LuCaP异种移植组织与成骨细胞损伤之间的WNT基因表达水平(n个=5）与非成骨细胞损伤(n个= 15).
图7
图7
CRPC细胞和成骨细胞中WNT7B信号的示意模型。
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