Hypertonic stress promotes autophagy and microtubule-dependent autophagosomal clusters

doi:10.4161/auto.23662

.2013年4月；9(4):550-67.

doi:10.4161/auto.23662。 Epub 2013年2月4日。

高渗应激促进自噬和微管依赖性自噬体簇

保拉·奈斯¹, 托马斯·欧南德斯, 伊莎贝尔·罗斯, 小木巧, 德博拉·斯特雷贝尔, 理查德·布利, 安妮·查罗莱, 皮埃尔路易吉·拉马多里, 米开朗基罗·福蒂, 保罗·梅达, 埃里克·弗雷尔, 丹尼斯·布朗, 乌多·哈斯勒

附属公司

PMID： 23380587
预防性维修识别码： PMC3627670型
内政部： 10.4161/自动23662

高渗应激促进自噬和微管依赖性自噬体簇

保拉·奈斯等。自噬. 2013年4月.

.2013年4月；9(4):550-67.

doi:10.4161/auto.23662。 Epub 2013年2月4日。

作者

保拉·奈斯¹, 托马斯·欧南德斯, 伊莎贝尔·罗斯, 小木巧, 德博拉·斯特雷贝尔, 理查德·布利, 安妮·夏洛莱, 皮埃尔路易吉·拉马多里, 米开朗基罗·福蒂, 保罗·梅达, 埃里克·弗雷尔, 丹尼斯·布朗, 乌多·哈斯勒

附属

¹瑞士日内瓦，日内瓦大学细胞生理学和代谢系。

PMID： 23380587
预防性维修识别码： PMC3627670型
内政部： 10.4161/自动23662

摘要

渗透稳态对大多数细胞来说是基本的，它们面临着环境渗透压的反复变化，从而挑战细胞的生存能力。蛋白质损伤是高渗应激的结果，但自噬是否有助于渗透压保护反应尚不清楚。在这里，我们研究了自噬和微管组织对高渗应激反应的可能影响。我们发现，高渗能快速诱导长寿命蛋白质降解、LC3-II生成和Ptdlns3K依赖性形成LC3-和ATG12-阳性斑点。溶酶体促生长剂氯喹和巴非霉素A 1，但没有营养剥夺或雷帕霉素治疗，进一步增加了LC3-II的生成，以及ATG12阳性斑点，表明高渗应激增加了自噬流量。高渗应激诱导自噬可提高细胞存活率，因为ATG12 siRNA介导的敲除可增加细胞死亡，而雷帕霉素可降低细胞死亡。我们还发现，高渗诱导了微管网络的快速重组，这与中心体微管的强烈重组和高尔基带的断裂有关。微管重构与与SQSTM1/p62和泛素共定位的ATG12阳性自溶体的中心体周聚集有关，表明高渗应激诱导的自噬至少具有部分选择性。高渗应激引起的有效自噬需要微管重塑，并且是DYNC/动力蛋白依赖性的，因为自噬体聚集通过紫杉醇诱导的微管稳定而增强，并通过诺可达唑诱导的微管蛋白解聚以及化学（EHNA）或遗传[DCTN2/动力蛋白2（p50）过表达]而减少DYNC活性的干扰。数据记录了一种迄今为止被忽视的普遍机制，其中自噬和微管重塑在渗透保护反应中发挥着重要作用。

关键词：ATG12；高尔基体；MAP1LC3/LC3；MAPRE1/EB1；MTOC；SQSTM1/p62；细胞凋亡；自噬；动力蛋白；溶酶体；微管；渗透胁迫；蛋白酶体；雷帕霉素；微管蛋白；泛素。

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数字

**图1。**高渗应激增加自噬流量。(A类)LLC-PK的变化₁连续暴露于等渗培养基或用NaCl（350和500 mOsmol/kg）激发的细胞中的细胞体积。黑色箭头表示细胞受到挑战的时间。细胞体积的一半最大恢复时间（R_v（v）t吨_1/2)和稳态恢复体积（R_v（v）max）显示在右边。(B类)营养剥夺或NaCl-高浓度胁迫（500 mOsmol/kg）导致的蛋白质降解被量化为[^三【H】我-缬氨酸在细胞培养基中释放。(C类)在营养靶细胞、NaCl激发的细胞或同时受到这两种刺激的细胞中，LC3-I转化为LC3-II。LC3-II水平的量化如右图所示。(D类)共聚焦z堆叠显示营养剥夺1小时或NaCl激发30分钟后ATG12阳性点状细胞数量增加。白色箭头描绘了NaCl挑战时的大型顶端颗粒。(E类)共焦z堆描绘了用NaCl（400 mOsmol/kg）攻击30分钟的原代人单核细胞和分化的巨噬细胞中形成核周ATG12阳性斑点(F类)左侧的免疫印迹描绘了用NaCl（500 mOsmol/kg）刺激30分钟、雷帕霉素（Rapa；200 nM）刺激24小时或雷帕霉素和NaCl刺激细胞后LC3-I转化为LC3-II的过程。右侧的免疫印迹描绘了用NaCl（500 mOsmol/kg）刺激90分钟、氯喹（100µM）刺激30分钟、巴非霉素A刺激的细胞中LC3-I转化为LC3-II的过程₁（100 nM）刺激1小时，或先用NaCl刺激细胞，然后在剩余刺激时间内用溶酶体促生长剂刺激细胞。LC3-II水平的定量显示在免疫印迹下面。白条：10µm。

**图2。**高渗应激诱导自噬有助于保护细胞免受死亡。(A类)用干扰siRNA或siRNA转染细胞*ATG12型*在量化细胞死亡之前，用NaCl（400或500 mOsm0l/kg）激发或不激发（Ctl）48小时。左侧的面板描述了典型流式细胞术实验的数据，细胞死亡在右上角以图形表示。右下角的图表描绘了转染siRNA的细胞释放LDH的增加*ATG12型*高渗应激48h(B类)相位对比显微镜显示转染siRNA的细胞空泡化和脱离增加*ATG12型*用高渗介质激发48h。(C类)在流式细胞仪分析细胞死亡之前，用雷帕霉素（200 nM）预处理或不预处理细胞（Ctl）24 h，然后用等渗或NaCl-高渗透培养基（600或700 mOsmol/kg）再激发48 h。细胞死亡在右侧以图形表示。(D类)在无雷帕霉素或有雷帕霉素的情况下，用等渗或高渗培养基激发细胞的相差显微镜观察。白条：10µm。

**图3。**高渗应激诱导自溶体的核周聚集。(A类)共焦z堆叠描绘了随着时间的推移，通过NaCl激发（500 mOsmol/kg）形成ATG12-阳性斑点。他们的组成被双方废除*ATG12型*siRNA和LY-294002（5µM），并通过甘露醇（500 mOsmol/kg，30分钟）进行复制。粒子的尺寸分布如右图所示。(B类)免疫印迹显示，在受到NaCl（500 mOsmol/kg）攻击的细胞中，LC3-I随着时间的推移转化为LC3-II。LC3-II水平的量化如下所示。(C类)单帧共聚焦图像描绘了在不存在和存在氯喹（100µM）或巴非霉素A的情况下，NaCl激发（30分钟）后，ATG12与RFP标记的LAMP1在核周簇中共定位₁（100 nM）。ATG12与LAMP1共同定位的百分比如下图所示。(D类)用NaCl刺激或不刺激细胞（Ctl）30分钟、雷帕霉素（200 nM）24小时、氯喹（100µM）6小时、巴非霉素A刺激或不攻击细胞（Ct1）中ATG12阳性点状物的共聚焦z堆叠₁（100 nM）刺激1小时，MG132（10µM。(E类)ATG12阳性细胞点状点的顶部共焦z轴叠加由白色矩形勾勒(D类)如图所示。(F类)显示了z堆栈和顶点z堆栈中包含的粒子的大小分布和数量。顶点z堆栈的获取如所述*材料和方法*。白条：10µm。

**图4。**高渗应激会增加选择性自噬。(**A和B**)描述ATG12与SQSTM1共定位的单帧共焦图像(A类)和泛素化蛋白(B类)NaCl激发后的核周簇（500 mOsmol/kg，30分钟）。白色箭头显示了显示良好协同本地化的区域示例。(C类)表中描述了ATG12和SQSTM1之间的共定位或核周簇中的泛素。(D类)免疫印迹显示，在NaCl激发30和60分钟后，SQSTM1表达降低。右侧显示了SQSTM1水平的量化。白条：10µm。

**图5。**高渗应激改变MT动力学。(A类)在等渗条件下（−NaCl）或NaCl激发后（+NaCl，500 mOsmol/kg），每隔12秒在6分钟的时间内收集GFP标记的TUBA1B在活细胞基底区的旋转圆盘图像。每个延时帧都被分配了不同的颜色，所有30张图像都被叠加为一张图像。在等渗条件下，运动的纤维丝产生彩色图像，而在高渗条件下图像则少得多，说明纤维运动减少。顶部显示的是激发前300秒和12秒以及激发后12秒和2700秒相同细胞放大区域的单帧图像。视频S1描述了高渗激发时MT运动性降低。(B类)基础GFP标记的MAPRE1的旋转磁盘图像，显示在NaCl、紫杉醇（紫杉醇，10µM）或诺可唑（10µM）激发后，MT plus-ends释放MAPRE1。指示挑战后的时间（秒）。视频S2描述了高渗激发时MAPRE1的释放。(C类)在高渗激发（500 mOsmol/kg）或添加诺卡唑（10µM，10 min）或紫杉醇（10μM，10分钟）后，对GFP标记的TUBA1B聚合进行量化。量化图像的示例如图S3C所示。(D类)TUBA的共聚焦z堆栈显示了高渗激发、诺卡唑和紫杉醇（30分钟）引起的MT组织改变。(E类)左侧TUBA的共聚焦z堆栈显示了在等渗条件下（Ctl）和高渗激发后30分钟（NaCl，500 mOsmol/kg）的MT网络。白色箭头表示中心体MT通过高渗应力成核。TUBA（绿色）和TUBG（红色）的放大3D投影，中心体MTOC的标记，在底部描绘了中心体MT成核。视频S3中也显示了这一点。右侧的共聚焦图像显示了高渗激发30分钟（400 mOsmol/kg）后，人类原代单核细胞和分化的巨噬细胞中心体MT核化。显示了基底面和顶面的单帧图像，相对于它们与玻璃盖玻片的粘附，以及覆盖整个细胞的z堆叠。白条：10µm。

**图6。**MT网络在高渗压力下重组。(A类)在等渗条件下（Ctl）或高渗激发30分钟后（500 mOsmol/kg），TUBA（绿色）与GOLGA2（顺-高尔基标记物）或TGOLN2（反-高尔基标志物）（红色）共聚焦z叠加。(B类)共聚焦z堆显示了等张条件下（Ctl）的基底GFP标记MAPRE1彗星，它们在NaCl激发2分钟（500 mOsmol/kg）后扩散，以及激发30分钟后顶端彗星的出现。下面显示的是由白色矩形勾勒的细胞基底、中段和顶端区域的单帧图像。(C类)在等渗条件下（Ctl）或NaCl激发30分钟后，GFP标记的MAPRE1（绿色）与GOLGA2或TUBG（中心体MTOC的标记物（红色）共聚焦z叠加。右侧显示的是GA和中心体所在的细胞中段和顶端区域的单帧图像。(D类)在等渗条件下（Ctl）或高渗激发30分钟后，TUBA（绿色）与ATG12或LysoTrackerRed共聚焦z叠加。白条：10µm。

**图7。**MT网络和DYNC的重排是高渗应激引起核周自溶体积聚的必要条件。(A类)一种典型的免疫印迹描绘了在单独用NaCl（500 mOsmol/kg）激发30分钟、单独用诺卡唑（10µM）或紫杉醇（紫杉醇，10µM）激发45分钟、或首先用药物激发，然后在培养的最后30分钟内添加NaCl的细胞中LC3-I转化为LC3-II的过程。LC3-II水平的量化如右图所示。(B类)左侧的共聚焦z堆栈显示了受到NaCl、诺卡唑或紫杉醇攻击的细胞中ATG12阳性点状物，如(A类)或用EHNA（500µM）单独或在培养的最后30分钟内添加NaCl激发24小时。右侧的共聚焦z堆显示了用DCTN2或空载体转导的细胞中ATG12阳性点状突起，然后用NaCl激发或不激发30分钟(C类)ATG12阳性细胞点状点的顶部共焦z轴叠加由白色矩形勾勒(B类)如图所示。(D类)显示了z堆栈和顶点z堆栈中包含的粒子的大小分布和数量。顶点z堆栈的获取如所述*材料和方法*. (E类)在不存在或存在EHNA的情况下，用NaCl攻击的细胞中TUBA的共聚焦z堆叠。白条：10µm。

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