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.2013年4月15日；319(7):1028-42.
doi:10.1016/j.yexcr.2013.01.013。 Epub 2013年1月29日。

固有表型可塑性促进头颈癌的进展：内皮细胞特性使血管生成和侵袭

孟童 1, Byungdo B Han公司, 安德鲁·霍尔普奇, 裴萍（Ping Pei）, 何凌力, 苏珊·马勒里
附属公司

固有表型可塑性促进头颈癌的进展：内皮细胞特性使血管生成和侵袭

孟童等人。 Exp单元Res. .

摘要

EMT（上皮间充质转化）、EndMT（内皮间充质转换）和VM（血管生成拟态）的存在表明癌症表型可塑性的多向程度。先前的研究结果表明，头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）和血管内皮生长因子（VEGF）之间的串扰表明，HNSCC细胞与内皮细胞具有一些功能共性。我们目前的结果表明，培养的HNSCC细胞不仅具有内皮特异性标记物，而且还显示内皮功能特征，包括低密度脂蛋白摄取、Matrigel上管状结构的形成以及对VEGF和内皮抑素的生长状态反应。HNSCC细胞亚群对转化生长因子-β1也有高度反应，并表达其辅助受体endoglin。此外，体外观察到的内皮细胞特征再现了人类HNSCC肿瘤中观察到的表型特征。相反，培养的正常人口腔角朊细胞和完整或溃烂的人口腔上皮细胞不表达可比较的内皮特性，这意味着内皮特性的假设仅限于转化的角朊上皮细胞。此外，这种表型状态相互作用通过增加促增殖和促血管生成因子的产生，通过低密度脂蛋白内化保存细胞能量储存，并增强细胞流动性，促进HNSCC进展。最后，对内皮细胞表型转变的认识为评估以前仅被视为血管抑制剂的治疗药物的抗肿瘤潜力提供了坚实的理论基础。

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数字

图1
图1
HNSCC细胞表达内皮相关蛋白。（A） 血管内皮细胞间粘附分子VE-cadherin在HUVECs和HNSCC细胞上的免疫细胞化学染色。HUVEC作为阳性对照。（B） Western印迹显示HNSCC细胞中存在VE钙粘蛋白，并显示细胞系依赖性表达水平。HUVEC裂解物中显示的额外低分子量条带可能代表了在HUVECs亚群凋亡期间VE-cadherin的蛋白水解片段[22]。VE-cadherin带密度与匹配的β-actin带密度的比值显示在底部。通过ICC染色（数据未显示）或Western Blot（在单独的凝胶上分析），正常HOK不表达VE-cadherin。
图2
图2
HNSCC细胞表达波形蛋白和CD31蛋白。左侧四个面板：内皮/间充质细胞内中间丝波形蛋白（红色）及其上皮对应物细胞角蛋白6（绿色）的双重染色。虽然HUVEC普遍表达波形蛋白（A），但每个HNSCC细胞系中只有一个细胞亚群显示波形蛋白阳性染色（C，E，G）。细胞角蛋白6（绿色）仅在HNSCC细胞（C、E、G）中表达。右侧四个面板：CD31的免疫细胞化学染色。HUVEC表现出典型的CD31（B）膜表达。HNSCC细胞亚群显示CD31（D，F，H）的胞浆染色。
图3
图3
HUVEC和HNSCC细胞在Matrigel上形成管状网络。将对数生长的HUVEC、HOK和HNSCC细胞添加到Matrigel预涂层的24孔板中，然后培养17小时。HUVEC培养物产生精细的管状结构，而HNSCC的细胞排列在较粗的网络中。然而，HOK细胞保持在分散的单层中，并没有显示相同的细胞相互作用模式。
图4
图4
HNSCC细胞内吞AcLDL，在TGF-β1刺激后增强。（A） 定性研究。将作为阳性对照的亚流入HUVEC、HOK或HNSCC细胞暴露于10μg/ml Alexa Fluor 488共轭AcLDL（绿点）中4 h。用0.08%的台盼蓝淬灭细胞外Alexa Fuor488信号，然后用PBS冲洗两次。CD31和E-cadherin染色（红色）分别描绘HUVEC或HOK和HNSCC细胞间边界。细胞核用DAPI（蓝色）复染。正常口腔粘膜作为E-钙粘蛋白的阳性对照。（B）定量研究。用0（对照）或10 ng/ml TGF-β1（24 h）处理HNSCC细胞，然后进行Alexa Fluor 488共轭AcLDL培养和台盼蓝淬灭。然后获得AcLDL内化数据，并根据分析特定的标准曲线进行量化。数据标准化为ng-LDL/105细胞。HUVECs（n=8）和转化的单核细胞系U937（n=3）作为阳性对照。
图5
图5
TGF-β1在HNSCC细胞中诱导内皮细胞表型。（A） 用0（对照）或10 ng/ml TGF-β1处理SCC15细胞24 h，然后对上皮表型细胞间粘附分子E-钙粘蛋白和三种内皮标记物CD31、波形蛋白和VE-钙粘蛋白进行免疫细胞化学染色以证明对照组和TGF-β1治疗组之间的细胞密度具有可比性。（B） 对HUVECs（阳性对照）和三种HNSCC细胞系的细胞裂解物进行Endoglin ELISA，用10ng/ml TGF-β1预处理或对照预处理48小时。将Endoglin水平标准化为pg/mg总蛋白，数据表示为平均值±S.E.M。由于HUVECs和HNSCC细胞的内皮素水平差异很大，因此对Y轴进行了切片。（C） 在48小时细胞侵袭试验之前，将SCC9和SCC15细胞暴露于0（对照）或10 ng/ml TGF-β1中24小时。根据细胞系特异性标准曲线测定侵入细胞数。误差条表示平均值的标准误差，n=5。
图6
图6
内皮相关蛋白也存在于HNSCC肿瘤中。5份完整的正常口腔上皮样品、10份溃疡性非肿瘤性口腔粘膜活检和24份HNSCC肿瘤组织分别进行了全血细胞角蛋白和三种传统间充质和/或内皮标记物（即波形蛋白、CD31和VE-cadherin）的IHC染色。每列显示的图像代表同一组织标本的相同显微视野。正常、完整的口腔上皮以广泛的细胞角蛋白阳性为特征，波形蛋白、CD31和VE钙粘蛋白阳性仅限于结缔组织细胞（波形蛋白）和内皮细胞（CD31和VE钙粘蛋白）。相反，溃疡附近的口腔上皮显示波形蛋白阳性。原发性HNSCC肿瘤表现为角蛋白强阳性，波形蛋白和CD31表达中到高，VE-粘附素适度。转移性肿瘤细胞和肿瘤边缘进展显示“内皮”标记物水平较高。有趣的是，许多“内皮标记”肿瘤细胞保留了细胞角蛋白的双重表达。在坏死周围组织区，内皮细胞、一些浸润性炎症细胞和HNSCC细胞中观察到CD31阳性。
图7
图7
VEGF激活HNSCC和内皮细胞中类似的信号通路。（A） VEGF诱导Erk1/2和Src的快速磷酸化。24 h血清剥夺的CAL27细胞用50 ng/ml VEGF激发0、1、5、10、20、30或60 min。然后获得细胞裂解物，用于Erk1/2和Src的总水平和磷酸化水平的Western Blot分析。（B） 内皮抑素（10μg/ml）预处理降低了CAL27细胞内信号传导，表现为与对照培养物相比，VEGF介导的Erk1/2和Src磷酸化降低。值得注意的是，60分钟内皮抑素预处理可消除CAL27对VEGF诱导的磷酸化反应。磷酸化总蛋白和匹配总蛋白的强度比显示在每个部分的底部。
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