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.2013;8(1):e53487。
doi:10.1371/journal.pone.0053487。 Epub 2013年1月22日。

帕金森氏α-突触核蛋白的温度依赖性结构变化揭示了预先存在的低聚物在α-突触体蛋白纤维化中的作用

附属公司

帕金森氏α-突触核蛋白的温度依赖性结构变化揭示了预先存在的低聚物在α-突触体蛋白纤维化中的作用

温尼·阿里桑迪等。 公共科学图书馆一号. 2013.

摘要

α-突触核蛋白的淀粉样纤维是沉积在帕金森氏病大脑实质黑质中路易小体的主要成分。α-突触核蛋白是一种内在无序的蛋白质,缺乏紧密的二级和三级结构。为了加深对其结构和功能关系的理解,我们利用温度处理研究了α-突触核蛋白的构象变化及其后续影响。我们发现,经过1小时的高温预处理(>80°C)后,α-突触核蛋白原纤维化被显著抑制。然而,温度熔化和圆二色光谱表明,α-突触核蛋白是完全可逆的,核磁共振研究表明,在95°C处理后,α-联核蛋白没有明显的结构变化。通过使用交联和分析超速离心,发现高温处理后,少量预先存在的α-突触核蛋白低聚物减少。此外,α-突触核蛋白的C末端也发生了一小部分截断。预先存在的α-突触核蛋白低聚物的减少可能有助于减少阻碍淀粉样纤维化动力学的种子效应。总的来说,我们的结果表明,预先存在的寡聚物物种是促成α-突触核蛋白原纤化的关键因素。我们的结果有助于理解α-突触核蛋白原纤化。

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数字

图1
图1。高温预处理抑制α-突触核蛋白原纤维的形成。
(A) α-突触核蛋白(25µM)在20(•)、40(▴), 60 (▪), 80(⋄)和95(▹) 在室温下,通过添加20µM ThT,以1000 rpm的速度连续摇晃10天,监测纤维形成。(B) ThT试验中α-突触核蛋白终点产物的Western blotting。指出了预处理温度和分子量标记。
图2
图2。高温预处理后形成的α-突触核蛋白原纤维较少且不太密集。
孵育后α-突触核蛋白的纤维形态用TEM在20000×(比例尺 = 500 nm)和100000×(比例尺 = 100 nm)放大倍数。显示了预处理温度。
图3
图3。α-突触核蛋白的二级结构在温度预处理后保留,并在温度变性后完全可逆。
(A) 在5种不同温度(20(•)、40)下预处理后25µM处α-突触核蛋白的构象变化(▴), 60 (▪), 80(⋄)和95(▹) 在室温下,通过远紫外CD光谱检查了一小时的温度。数据表明,经温度预处理后,α-突触核蛋白采用了无构象变化的随机卷曲结构。(B) 用20(•,○) 或95°C(▸,▹). 温度从5℃升高到100℃(固体符号)或从100℃降低到5℃(空符号),温度变化速率为1.7℃/min。监测222 nm处的CD信号并绘制摩尔椭圆度。数据显示α-突触核蛋白在温度作用下发生完全可逆的折叠。实验中未发现蛋白质损失。
图4
图4。1小时-15α-突触核蛋白的N HSQC NMR谱和NMR动力学表明,温度预处理后的化学位移和弛豫速率没有显著差异。
(A) 1小时-15200µM的N个HSQC光谱15在20或95°C下预处理1小时后,在10 mM磷酸盐缓冲液中pH值为7.4的N标记α-突触核蛋白。所有光谱均在10°C下获得。(B) α-突触核蛋白的R2弛豫速率(○) 在80°C下未进行(•)预处理6小时。所有光谱均在10°C下获得。
图5
图5。新制备的α-突触核蛋白中存在瞬时低聚物。
α-突触核蛋白在5种不同温度下预处理1小时后,分别进行PICUP和western blotting,使用抗突触核抗体anti-yn211。PICUP后观察到亚稳态低聚物,包括二聚体、三聚体、四聚体,高温预处理后低聚物数量减少。
图6
图6。预先存在的α-突触核蛋白低聚物在95°C处理后被破坏。
用AUC-SV分析了α-突触核蛋白在95°C(虚线)和无(实线)处理下的分布,并绘制了沉降系数在0到7S之间的分布图。插图是C(S)信号低于0.1的放大区域。
图7
图7。高温处理后,C端被截断。
(A) 在20(实线)和95°C(虚线)下处理1小时后,对α-突触核蛋白进行分析SEC。在280 nm吸光度下监测信号。显示了分子量标记。(B) 通过MALDI-TOF质谱仪,热处理后观察到的截短物种的分子质量为12004 kDa。(C) 从截短物种的LC/MS/MS中鉴定的序列与α-突触核蛋白的N末端和NAC区域相匹配。检测到的残基用粗体标记,箭头指示预测的截短位点。NAC区域已装箱。
图8
图8。C末端截短的α-突触核蛋白不发生纤维化。
分离全长(•)和C末端截短的纤维化分析(▪) α-突触核蛋白。用ThT荧光监测纤维化过程。

类似文章

引用人

工具书类

    1. Spilantini MG、Schmidt ML、Lee VMY、Trojanowski JQ、Jakes R等(1997)【α】-路易体中的突触核蛋白。《自然》388:839-840。-公共医学
    1. Shulman JM、De Jager PL、Feany MB(2011)《帕金森病:遗传学和发病机制》。《病理学年鉴》6:193-222。-公共医学
    1. Bonini NM,Giasson BI(2005年),研究α-同核蛋白的功能。手机123:359–361。-公共医学
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    1. Cooper AA、Gitler AD、Cashikar A、Haynes CM、Hill KJ等人(2006){α}-突触核蛋白在帕金森病模型中阻断ER-Golgi交通和Rab1拯救神经元丢失。科学313:324-328。-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型

赠款和资金

该研究的资金来自台湾中央研究院基因组研究中心和台湾国家科学委员会(98-2320-B-001-020-MY3和101-2320-B-001-035)。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。