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.2013年3月；24(6):848-57.
doi:10.1091/mbc。E12-08-0597。 Epub 2013年1月16日。

cAMP刺激的透明蛋白1磷酸化调节肾上腺皮质细胞中蛋白质的稳定性和与结合伙伴的相互作用

李东辉 1, 埃里克·B·达姆, 娜塔莎·C·勒基, 马里恩B下水道
附属公司

cAMP刺激的透明蛋白1磷酸化调节肾上腺皮质细胞中蛋白质的稳定性和与结合伙伴的相互作用

李东辉等。 分子生物学细胞. 2013年3月.

摘要

隔膜同源物1（DIAPH1）是一种Rho效应蛋白，通过调节微丝和微管功能来协调细胞动力学。我们之前的研究表明，DIAPH1通过控制线粒体运动速率，在调节皮质醇的生成方面发挥着不可或缺的作用，通过线粒体运动，促肾上腺皮质激素（ACTH）/cAMP信号通路的激活刺激线粒体运输，并促进RhoA和DIAPH2之间的相互作用。在本研究中，我们使用质谱法鉴定了DIAPH1结合伙伴，并发现DIAPH2与几种蛋白质相互作用，包括RhoA、dynamin-1、kinesin、β-微管蛋白、β-肌动蛋白、氧化甾醇结合蛋白（OSBP）相关蛋白2（ORP2）和ORP10。此外，通过需要细胞外信号相关激酶（ERK）的途径，在Thr-759处对二丁酰基cAMP（Bt2cAMP）进行磷酸化。Thr-759的丙氨酸取代使DIAPH1更加稳定，并减弱DIAPH1-与驱动蛋白、ORP2和肌动蛋白之间的相互作用，但对蛋白质与RhoA或β-微管蛋白相互作用的能力没有影响。最后，DIAPH1 T759A突变体的过度表达显著降低了Bt2cAMP刺激的线粒体运动的速率。总之，我们的发现确立了磷酸化在调节隔膜1的稳定性和功能方面的关键作用。

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图1：
图1：
（A） H295R细胞裂解物的代表性凝胶，使用抗DIAPH1抗体进行免疫沉淀，并进行SDS-PAGE和考马斯染色。免疫沉淀和质谱分析分三次进行。星号表示为质谱分析而切除的谱带。（B） GFP标记或内源性DIAPH1从对照或Bt中免疫沉淀2cAMP处理过的样品（0.4 mM，30 min）和固定化蛋白被清洗，用SDS-PAGE分离，并使用抗驱动蛋白（重链）、动力蛋白-1、β-微管蛋白、RhoA或波形蛋白的抗体进行蛋白质印迹分析。5%的输入物使用抗GFP抗体进行SDS-PAGE和Western blotting。所示斑点具有代表性，每次免疫沉淀至少进行三次，每次重复一次。（C） 对照或Bt的裂解物2cAMP处理的H295R细胞使用抗OPR2抗体进行免疫沉淀（输入；从上往下第二个），蛋白A/G琼脂糖或H295R电池转染pEGFP-DIAPH1和对照或Bt2使用抗GFP抗体和蛋白A/G琼脂糖免疫沉淀的cAMP刺激裂解物（输入；底部）。用SDS-PAGE对固定化蛋白进行清洗、分离，并使用针对DIAPH1（输出；顶部）或ORP10（输出，从底部开始第二个）的抗体进行Western blotting分析。免疫沉淀进行了三次，每次重复进行。（D） 将H295R细胞接种在100 mm的培养皿上，用5μg兔IgG、抗ORP2或ORP4免疫沉淀裂解物，并用SDS-PAGE分离纯化蛋白。对ORP2（中间）或ORP4（底部）5%的输入和DIAPH1（顶部）的输出进行蛋白质印迹。所示为三次独立研究的代表性斑点，每次重复。
图2：
图2：
（A） 用WT或磷酸化突变体pEGFP-DIAPH1转染H295R细胞，并用抗GFP抗体和蛋白A/G琼脂糖免疫沉淀裂解产物。固定化蛋白进行SDS-PAGE，然后使用抗磷酸化Ser/Thr抗体进行蛋白质印迹。10%的输入物使用抗GFP抗体进行SDS-PAGE和Western blotting。磷-Ser/Thr和GFP表达的密度分析表示为与野生型相比的倍数变化，数据表示四个实验的平均值±SD，每个实验重复进行。（B） DIAPH1一级结构上假定磷酸化位点的位置。（C） THAPH1的T-Coffee序列比对，突出了不同物种中保守苏氨酸残基（人类中的T759）的位置。
图3：
图3：
（A） 用WT或T759A突变体pEGFP-DIAPH1转染H295R细胞，并用0.4 mM Bt处理30分钟2使用抗GFP抗体和蛋白A/G琼脂糖对血浆、cAMP和裂解物进行免疫沉淀。用SDS-PAGE对固定化蛋白进行洗涤、分离，并用抗磷酸（T759）-DIAPH1抗体进行Western blotting分析。5%的输入物使用抗GFP抗体进行SDS-PAGE和Western blotting。左侧为代表性斑点；右，密度分析。图形数据表示三个实验的平均值±SD，每个实验一式两份。（B） 用10μM H89或10μM U0126预处理H295R细胞，然后用0.4 mM Bt处理2cAMP 30分钟。收集细胞裂解物并通过SDS-PAGE分离，然后使用抗磷酸（T769）-DIAPH1或抗DIAPH1抗体进行Western印迹。左侧为代表性斑点；右，密度分析。图形数据表示五个实验的平均值±SD，每个实验一式两份。（C） 用H89或U0126预处理H295R细胞，然后用Bt处理2cAMP。收集细胞裂解物并通过SDS-PAGE分离，然后使用抗磷酸-ERK1/2或抗ERK2抗体进行Western blotting。左侧为代表性斑点；右，密度分析。图形数据表示五个实验的平均值±标准差，每个实验一式两份。（D） 与对照或Bt分离的裂解物2cAMP处理的细胞与λ-磷酸酶孵育，然后进行SDS–PAGE和蛋白印迹以检测pDIAPH1或DIAPH1。左侧为代表性斑点；右，密度分析。图形数据表示两个实验的平均值±SD，每个实验一式两份。在所有图表中，星号表示统计显著性(第页<0.05）。
图4：
图4：
（A） 用WT或T759A突变体pEGFP-DIAPH1转染H295R细胞，并用50μg/ml CHX处理3或6 h。收集细胞裂解物并用SDS-PAGE分离，然后用抗GFP和抗GAPDH抗体进行Western blotting。（B） 对用50μg/ml CHX处理0-6小时的细胞中WT和磷酸化（T579）DIAPH1蛋白表达的Western blotting研究所得数据进行图形分析。数据表示四个单独实验的平均值±SEM，每个实验重复进行。星号和克拉表示统计上的不同(第页<0.05），分别来自WT 0-h和T759A 0-h组。（C） 用WT或T759A突变体pEGFP-DIAPH1转染H295R细胞，并用20μM MG132处理6 h。收集细胞裂解物并用SDS-PAGE分离，然后用抗GFP和抗GAPDH抗体进行Western印迹。左侧为代表性斑点；右，密度分析。图形数据表示三个实验的平均值±SD，每个实验一式两份。（D） 用0.4 nM Bt处理H295R细胞30分钟2cAMP是否存在20μM MG132。收集细胞裂解物并通过SDS-PAGE分离，然后使用抗磷酸（T759）-DIAPH1、抗DIAPH1和抗GAPDH抗体进行Western印迹。左侧为代表性斑点；右，密度分析。数据代表四个实验的平均值±标准差，每个实验一式两份。星号表示统计显著性(第页<0.05）。（E） 对照或Bt的裂解物2转染GFP标记的DIAPH1的cAMP处理细胞与抗GFP抗体和蛋白A/G琼脂糖孵育，免疫沉淀蛋白通过SDS-PAGE和免疫印迹分析SUMO-1。研究的代表性斑点分三次进行，每次重复两次。（F） 将转染WT或T759A GFP标记的DIAPH1的细胞裂解液与抗GFP免疫沉淀，并通过SDS-PAGE和SUMO-1的Western blotting评估固定蛋白。研究的代表性斑点分两次进行，每次两次。
图5：
图5：
用WT或T759A突变体pEGFP-DIAPH1转染（A–F）H295R细胞，并使用抗GFP抗体和蛋白A/G琼脂糖免疫沉淀裂解产物。用SDS-PAGE对固定化蛋白进行洗涤、分离，并使用抗RhoA（A）、抗驱动蛋白（B）、抗β-肌动蛋白（C）、β-微管蛋白（D）、抗ORP2（E）或抗ORP10（F）抗体进行Western blotting分析。5%的输入物使用抗GFP抗体进行SDS-PAGE和Western blotting。所有共免疫沉淀至少进行了三次，至少重复一次。每个斑点上面的数据代表平均值±SD，星号表示与WT有显著差异(第页< 0.05).
图6：
图6：
（A） 将H295R细胞镀在盖玻片上并转染WT或T759A突变型pEGFP-DIAPH1和Mito Tracker Red的典型共焦显微镜图像2cAMP。蔡司成像生理学平台用于根据视频记录确定单个线粒体的运动速度。每帧曝光时间为1s，帧间间隔为3s。通过减去每帧间隔后位置的变化来计算线粒体运动（μm/s）。图中数据表示三个单独实验的平均值±SEM。每个实验重复中至少分析20个线粒体。星号和克拉表示统计上的差异(第页<0.05）来自WT控制和Bt2cAMP处理组。
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