跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

HTTP服务器

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2013年1月至2月；4(1):61-73.
doi:10.4161/nucl.23388。 Epub 2013年1月1日。

具有复合杂合LMNA突变的层粘连患者的软基质使成纤维细胞的核形态正常化并防止核破裂

奇亚拉·塔米列洛 1, 米里亚姆·A·F·坎普, 亚瑟·范登·维恩加德, 瓦莱丽·L·R·M·弗斯特雷顿, 弗兰克·P·T·巴伊延斯, Jos L V Broers公司, Carlijn C V Bouten公司
附属公司

软基质使核形态正常化并防止复合杂合LMNA突变的椎板病患者成纤维细胞核破裂

奇亚拉·塔米略等。 核. 2013年1月至4月.

摘要

主要由LMNA基因突变引起的层粘连蛋白病是一组具有高度可变外显率的遗传性疾病；即，具有相同LMNA突变的人的疾病谱从无症状状态到严重心肌病和早衰，导致早期死亡。LMNA突变导致细胞核异常和细胞脆性，以应对细胞机械应激，但这些疾病的基因型/表型相关性尚不清楚。因此，突变分析等工具不足以预测疾病的进程。在这里，我们利用生长基质刚度来探测一名患有复合进展综合征的椎板病患者培养的真皮成纤维细胞的核脆性。我们发现，在硬度高于10 kPa的基底上培养这些细胞会导致细胞核畸形甚至破裂，而在软基底（3 kPa）上培养可以保护细胞核免受形态改变和破裂。在任何基底硬度下，健康对照细胞均未发现畸形。此外，对该层粘连病细胞中肌动蛋白细胞骨架组织的分析表明，核异常的发生与细胞骨架张力的增加有关。总之，这些数据表明，在具有不同硬度的基底上培养这些LMNA突变细胞可用于探测核脆性的程度。该分析可能有助于预测患者特异性表型的发展，并有助于研究椎板病中核和细胞脆性的潜在机制。

关键词：叶片；椎板病；核破裂；核形态改变；基底刚度。

PubMed免责声明

数字

无
图1。底物硬度对细胞形态和肌动蛋白细胞骨架组织的影响。（A）NHDFα和LMNA公司mut细胞接种在刚度为3kPa～80kPa的聚丙烯酰胺凝胶上48小时。对于这两种细胞类型，在3 kPa聚丙烯酰胺凝胶上出现的细胞数少于在较硬的基质上出现的扩散细胞数。比例尺：100μm。（B）NHDFα和LMNA公司mut（指骨苷-TRITC，红色）在硬度大于3 kPa的底物上显示出组织和张力增加。层粘连蛋白B1染色呈绿色。比例尺：20μm。（C和D）单元面积和长宽比以盒须图表示。NHDFα和LMNA公司mut没有显示出显著差异，因此这些值被视为一组。
无
图2。基底硬度对核形态异常的调控。（A）用DAPI（蓝色）、层粘连蛋白B1（绿色）对细胞核进行免疫荧光标记，并将二者叠加在最右侧的面板上，以便区分正常（上排）和异常形状的细胞核（第二和第三排）。特别是，第二排的细胞核显示出突出物，第三排可以观察到气泡。比例尺：10μm。（B）异常形状的细胞核增加PA凝胶硬度的频率LMNA公司mut和控制NHDFα。值表示两个实验中至少300个单元格的平均值。棒材代表相同基底刚度下的SEM*p<0.05，**p<0.01 vs NHDFα（C）畸形细胞核频率差异的统计分析LMNA公司不同基底刚度下的mut和NHDFα。*，p<0.05；无星号，p>0.05。
无
图3。基质硬度对细胞骨架肌动蛋白组织和畸变的影响。从整个细胞的半高和NHDFα和LMNA公司播种后48小时，用免疫细胞化学方法对F-actin进行了染色，其中F-actin呈红色（指骨样蛋白-TRITC），Lamin B1呈绿色。（A）代表性成纤维细胞接种在3 kPa PA凝胶上。它显示出短而不紧绷的肌动蛋白纤维，这些纤维在核周区域缺失。细胞核上方有一个肌动蛋白帽（白色箭头）。两者之间没有差异LMNA公司mut和NHDFα。因此，在覆盖在软基质上的细胞的肌动蛋白细胞骨架中没有检测到畸变。（B）将硬度大于3 kPa的PA凝胶上的NHDFα精确控制在20 kPa PA凝胶上。核周区肌动蛋白应力纤维紧张且结构良好。肌动蛋白帽由厚的应力纤维构成，位于细胞核（白色箭头）的上方。（C和D）在中发现的典型畸变LMNA公司20号种子为mut（C）和80千帕（D）PA凝胶。细胞有一个畸形的细胞核。黄色箭头表示核周区缺乏肌动蛋白纤维（D和E）肌动蛋白的斑点分布（E）肌动蛋白帽位于细胞核上方（白色箭头）。比例尺：20μm。（E）三种基底刚度上细胞的代表性图像。NHDFα（左侧面板）和LMNA公司3kPa（F）、20 kPa（G）和80 kPa（H）PA凝胶上的mut（右侧面板）。比例尺：50μm。
无
图4。短暂性cytoD治疗对LMNA公司mut核。典型共焦截面LMNA公司接种在I型胶原涂层玻璃基质上的mut与细胞D 1μM一起孵育，并在正常生长培养基中回收。固定后，用DAPI（蓝色）对细胞进行染色以检查细胞核异常，用指骨样蛋白-TRITC（红色）检查肌动蛋白组织。（A）未经处理的控件LMNA公司多个。（B）短期治疗+短期恢复：LMNA公司用cytoD处理mut 30分钟，恢复1小时。（C）长期治疗+短期恢复：LMNA公司用cytoD处理mut 3 h，恢复1 h。（D）长期治疗+长期恢复LMNA公司用cytoD治疗mut 3小时，隔夜恢复。比例尺：20μm。（E）畸形核的频率LMNA公司用cytoD治疗后mut。每组至少评估600个细胞。*，p<0.05；无星，p>0.05
无
图5。胰酶处理后细胞附着后细胞核形状和肌动蛋白组织的改变。（A）典型共焦截面LMNA公司在接种后30分钟、1、2、4、24和72小时，将mut接种在I型胶原涂层的玻璃基板上。细胞免疫细胞化学染色，F-actin为红色（指骨样蛋白-TR），层粘连蛋白A/C为绿色。第4小时的插图：3D视图（由ImageJ 3D-viewer生成，显示细胞核（绿色）在细胞上部的位置，细胞核周围几乎没有紧张的肌动蛋白应力纤维（红色））。比例尺：10μm。（B）播种后畸形核的频率.*，p<0.05；无星号，p>0.05。（C） 使用Jol2层粘连蛋白A/C抗体通过免疫荧光观察附着后核泡大小的变化。注意核泡的大小增加以及异常的形状。还要注意的是，在大多数滤泡中可以看到典型的蜂窝状结构的薄层染色。比例尺：10μm。
无
图6。PML-NBs定位作为细胞分区的标志。（A−C）用拉明B1（红色）、DAPI（蓝色）和PML-NBs（绿色）免疫标记代表细胞核的共聚焦切片，以研究PML-NB的定位。细胞核用DAPI（蓝色）复染。最右边的面板显示了三层叠加。比例尺：10μm。（A）显示正常形态和PML-NB内部定位的细胞核。细胞分区完好无损。（B）PML-NB（cytPML-NBs）在细胞核周围的细胞质定位显示异常形态（白色箭头）。PML-NB向细胞质的退出表明细胞分区的丧失。（C）在正常形状的细胞核（白色箭头）中也可以发现CytPML-NB，这表明细胞分区的丢失与核形态异常没有直接关系。（D）NHDFα和LMNA公司mut显示cytPML-NBs。值表示两个实验中至少600个单元格的平均值。棒材代表相同基底刚度下的SEM*p<0.05，**p<0.01 vs NHDFα（E）cytPML-NB频率差异的统计分析LMNA公司不同基底刚度下的mut和NHDFα。*，p<0.05；无星号，p>0.05。
无
图7。软基底上不会发生核膜自发破裂。（A）从的延时录制中选择图像的蒙太奇LMNA公司在10 kPa PA凝胶上培养的mut细胞，转染EYFP-NLS，每隔1分钟取样2小时(视频S1). 核膜破裂导致核内EYFP信号减少，细胞质EYFP-信号增加（0:36，黄色箭头）。随后，细胞核逐渐接收到核信号，破裂似乎已恢复（0:51，橙色箭头）（B）细胞核中EYFP-NLS（平均）强度的时间演变如图所示（A）.（C）不同基底上的自发核膜破裂频率LMNA公司多个。误差条表示记录数量的平方根。
无
图8。提出肌动蛋白细胞骨架组织的机制以及对软硬底物上核异常的影响。播种在具有不同刚度的基板上的细胞的横截面示意图。红色代表肌动蛋白细胞骨架，而绿色代表细胞核（深绿色核膜）。（A）当播种在软基质上时，NHDFα和LMNA公司mut细胞有相同的反应。它们发育出不紧绷的肌动蛋白应力纤维，这些纤维与核周区的细胞核没有直接连接。纤维在细胞核的下面和上面运行。由于对细胞核施加的力较小，因此可以防止核异常的发生。（B）接种在坚硬基质（硬度大于3kPa）上的NHDFα细胞会产生拉紧的肌动蛋白应力纤维，这些纤维在整个细胞质中组织良好。应力纤维连接到细胞核并形成位于细胞核顶部的肌动蛋白帽。（C）LMNA公司刚性基底顶部的mut细胞产生张力纤维。这些应力纤维似乎在核周区域缺乏，肌动蛋白聚集体经常可见。肌动蛋白帽的推动作用（核顶部的应力纤维）以及推动肌动蛋白在核周围区域的不均匀分布导致核异常的发展，进而导致核损伤。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Gilbert PM、Havenstrite KL、Magnusson KEG、Sacco A、Leonardi NA、Kraft P等。基质弹性调节培养中骨骼肌干细胞的自我更新。科学。2010;329:1078–81. doi:10.1126/science.1191035。-内政部-项目管理委员会-公共医学
    1. Discher DE、Janmey P、Wang YL。组织细胞感受并响应其基质的硬度。科学。2005年；310:1139–43. doi:10.11126/science.1116995。-内政部-公共医学
    1. Wilson KL，Foisner R.层粘连蛋白。冷泉Harb Perspect生物。2010;2:a000554。doi:10.1101/cshperspect.a000554。-内政部-项目管理委员会-公共医学
    1. Crisp M，Liu Q，Roux K，Rattner JB，Shanahan C，Burke B，等。细胞核和细胞质的耦合：LINC复合体的作用。细胞生物学杂志。2006;172:41–53. doi:10.1083/jcb.200509124。-内政部-项目管理委员会-公共医学
    1. Huang H，Kamm RD，Lee RT。细胞力学和机械传递：途径、探针和生理学。美国生理学杂志《细胞生理学》。2004;287:C1-11。doi:10.1152/ajpcell.00559.2003。-内政部-公共医学