跳到主页面内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2013年4月；14(4):365-81.
doi:10.1111/tra.12041。 Epub 2013年2月4日。

酿酒酵母ER驻留蛋白的分析：H/KDEL检索序列的实现

Carissa L Young公司 1, 大卫·L·拉登, 安妮·S·罗宾逊
附属公司

酿酒酵母ER驻留蛋白的分析：H/KDEL检索序列的实现

Carissa L Young公司等。 交通. 2013年4月.

摘要

一个精细的质量控制系统通过确保蛋白质合成和成熟的保真度来调节内质网（ER）的稳态。在芽殖酵母中，基因组分析和高通量蛋白质组学研究已经确定了在局部扰动后恢复体内平衡的ER驻留蛋白。然而，这些折叠因子是如何调节应力的，这在很大程度上尚未探索。在本研究中，我们设计了一系列基于聚合酶链反应（PCR）的模块，包括密码优化表位和荧光蛋白（FP）变体，以及C末端H/KDEL检索基序。这些保守序列是大多数可溶性内质网蛋白固有的。为了同时监测多个蛋白质，H/KDEL盒具有六种不同的选择标记，为活体细胞成像和多色标记提供了最佳的灵活性。一对PCR引物可以用于扩增这26个模块，从而实现标签和选择标记的多种组合。通过使用所有新标签标记BiP/Kar2p、Pdi1p和Scj1p，证明了pCY H/KDEL盒的多功能性，从而提供了FP变体之间的直接比较。此外，为了推进酵母ER蛋白的体外研究，构建了带有C末端检索序列的Strep-tag II。在此，建立了生理条件下BiP的高效纯化策略。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。pCY H/KDEL磁带中关键组件的描述，改编自Young及其同事（77）
（A）用于该盒系列的模板的质粒图，其包含C末端ER检索序列（例如用五点星表示）。（B）所有pCY H/KDEL盒的广义核苷酸序列，类似于源自pFA6a-GFP（S65T）的模块（22）。与检索序列FEHDEL和MLKDEL相对应的核苷酸分别与BiP/Kar2p和Scj1p的最后六个氨基酸相同酿酒酵母为了扩增特定标签和选择标记，引物同源区域用斜体表示。已确定限制性位点，并在相应的核苷酸下划线。根据频繁使用的密码子酿酒酵母（38）由频率（即整个基因组中密码子使用的百分比）表示，并插入圣诞节和原件太平洋岛屿倡议限制站点，从而消除其唯一性。ADH1终端（TADH1（ADH1）)第页，共页酿酒酵母是所有pCY H/KDEL质粒的组成部分，这些质粒是由以下成分组成的亲本载体的衍生物kanMX（汉字）.（C）pCY H/KDEL系列所有蓝色、绿色、黄色和红色荧光蛋白变体的排列。（D）表位标记，c（c）-myc和HA含有密码子优化的（即酵母增强的（yE））序列。保持商业抗体亲和力的残留物以粗体显示。（E）改良的链霉亲和素标签，斯特雷普-tag II由N端凝血酶裂解位点和C端HDEL检索序列构建。识别的解理位置用（^）表示。由于凝血酶的酶活性，剩余的氨基酸被强调。这个斯特雷普-标签II表位以粗体显示。（F）使用标准同源重组技术设计正向和反向引物。
图2
图2
（A） 实现HDEL检索序列的BiP/Kar2p荧光蛋白融合表达与亲本菌株相比，GFP和DsRed变体融合到ER驻留蛋白BiP的凝胶内荧光分析。在457nm、488nm或532nm的激发波长下检测到FP融合。（B） Hsp70伴侣蛋白BiP的免疫印迹。Western blot分析显示相应车道类似于（A）；用抗Kar2p探针探测蛋白质条带，并通过适当的对照抗肌动蛋白将其与总蛋白质负荷进行比较。（C） 在非还原条件下通过凝胶内荧光分析比较全长BJ5464 BiP-FP融合。在457 nm、488 nm或532 nm的激发波长下检测到FP融合。变体的固有荧光未检测到低聚物和混合二硫化物。（D） Western blot分析证实在非还原条件下形成了一个物种。通过抗Kar2p探测内源性BiP（野生型），通过抗GFP探测BiP-FP融合。
图3
图3。评估酿酒酵母组成性表达BiP/Kar2p荧光蛋白融合的菌株
（A）对亲本菌株BJ5464（填充圆，野生型（WT））和由BiP/Kar2p融合到Cerulean（填充方形，CY2007）、Venus（开放三角形，CY2009）和mCherry（填充钻石，CY2014）的衍生物进行了时间进程实验。实验分为三份，并以图形表示为半对数图。对于每个时间点，平均±误差（即测量OD的最小或最大值600)表示。为了统计评估各自的倍增时间，在显著性水平α=0.5下进行了两次样本t检验。结果如插图（A）所示，其中平均倍增时间，t吨d日¯，由垂直条表示，误差条定义为平均值的标准误差。统计显著性产生相应的p值（竖线上方的数字）。（B）对亲本菌株BJ5464（填充圆，野生型（WT））和由BiP/Kar2p融合到酵母增强变体yEmCFP（填充方形，CY2016）、yEmCitrine（开放三角形，CY2012）和yEGFP（填充三角形，CY1013）组成的衍生物进行了时程实验。与（A）类似，实验以重复的方式完成，并在接种后18小时计算加倍时间，如材料和方法.还对融合到BiP/Kar2p的酵母增强型变异体进行了两个样本t检验，结果如插图（B）所示。（C） 免疫荧光显示内源性BiP在ER中的定位。在本研究中使用的所有三个亲本菌株中，用抗Kar2p检测BiP的内质网定位，详细描述了三个亚区：核内质网、外周内质网和连接小管。（D） BiP荧光蛋白的活细胞成像需要适当的ER检索序列（即FEHDEL）。通过共焦显微镜（蔡司780共焦显微镜，100×/NA 1.46）获得的指示菌株的荧光（左）和DIC（右）图像，如材料和方法所有比例尺均为5μm。
图4
图4
（A） 包含C末端HDEL检索序列的Pdi1p荧光蛋白融合表达与亲本菌株相比，GFP和DsRed变体融合到蛋白二硫异构酶Pdi1p的凝胶内荧光分析。在457 nm、488 nm或532 nm的激发波长下检测到FP融合。（B） 免疫印迹检测荧光蛋白融合。Western blot分析显示相应车道类似于（A）；用抗GFP检测蛋白带，并通过适当的负载控制，即抗Tubulin，将其与总蛋白进行比较。（C） 定位于ER的Pdi1p荧光蛋白融合的活细胞成像。通过共焦显微镜获得的指示菌株的荧光（左）和DIC（右）图像，如材料和方法（蔡司780共焦显微镜，100×/NA 1.46）。（D） 蓝色荧光蛋白变体yECFP和yEmCFP的实现和优化，融合到Pdi1p。Pdi1p融合蛋白的活细胞成像-荧光（左）和DIC（右）-通过GaAsP探测器（蔡司780共焦显微镜，100×NA 1.46）在458 nm的激发下提高灵敏度获得。所有比例尺均为5μm。
图5
图5
（A） 实现C端KDEL检索序列的Scj1p-GFP变体的表达与亲本菌株相比，融合到Scj1p的黄色GFP变体的In-gel荧光分析。GFP变体在488nm处被激发。（B） Scj1p融合蛋白的免疫印迹分析。Western blot分析显示相应车道；用抗GFP探针探测蛋白带，并通过适当的对照物抗肌动蛋白比较总蛋白载量。（C） Scj1p-GFP变体的活细胞成像。通过共焦显微镜（蔡司780共焦显微镜，100×/NA 1.46）获得的指示菌株的荧光（左）和DIC（右）图像，如材料和方法所有比例尺均为5μm。（D） 的增长率酿酒酵母组成性表达ER-受体蛋白的菌株与具有选择性H/KDEL检索序列的Venus融合。对亲本菌株BJ5464（实心圆圈，野生型（WT））和由BiP/Kar2p（开放三角形，CY2009）、Pdi1p（开放方形，CY2017）和Scj1p（开口钻石，CY2021）组成的衍生物与金星融合进行了时间进程实验（例如，分别为pCY3051-01或pCY302-01）。实验分为三份，并以图形表示为半对数图。对于每个时间点，平均±误差（即测量OD的最小或最大值600)表示。为了统计评估各自的倍增时间，在α=0.5的显著性水平下进行了两个样本t检验。结果显示在（D）的插图中，其中平均加倍时间，t吨d日¯，由垂直条表示，误差条定义为平均值的标准误差。统计显著性产生相应的p值（竖线上方的数字）。
图6
图6。重组BiP成功纯化自酿酒酵母在生理条件下。（A） BiP的表达-斯特雷普-标签II，采用HDEL检索图案设计
ER分子伴侣BiP/Kar2p重组表达的Western blot分析斯特雷普-tag II融合蛋白，与野生型相比。用anti探测蛋白质条带-斯特雷普-标签®二、。（B） 的插图斯特雷普-标签II/斯特雷普Tactin纯化，Schmidt和Skerra修改的示意图(90).含有宿主蛋白和重组BiP的细胞裂解液用于固定化条纹塔钦。通过连续洗涤去除宿主蛋白质。商业保险-斯特雷普-然后，标签II-HDEL通过与低浓度的D-去硫生物素竞争而被取代。为了再生色谱柱，添加HABA可以加速D-去硫生物素的去除。（C） BiP的提纯策略和回收-斯特雷普-标签II-HDEL。重组表达和纯化BiP的分析-斯特雷普-标签II-HDEL。最初，将清除的细胞裂解物（负载，总计4.6 mL）应用于斯特雷普收集Tactin树脂（2.5毫升柱体积）和流通（FT，4.6毫升）。依次清洗色谱柱五次（W，每次5 mL），然后洗脱BiP-斯特雷普-标签II-HDEL（E，8×1.25 mL，含2.5 mM D-去硫生物素）。所有馏分均归一化为整个净化方案中使用的体积。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Ghaemaghami S、Huh WK、Bower K、Howson RW、Belle A、Dephoure N、O'Shea EK、Weissman JS。酵母中蛋白质表达的全局分析。自然。2003;425(6959):737–741.-公共医学
    1. Ron D，Walter P.内质网中的信号整合揭示了蛋白质反应。Nat Rev Mol细胞生物学。2007;8(7):519–529.-公共医学
    1. Tabas I，Ron D.整合内质网应激诱导的凋亡机制。自然细胞生物学。2011;13(3):184–190.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Travers KJ、Patil CK、Wodica L、Lockhart DJ、Weissman JS、Walter P.功能和基因组分析揭示了未折叠蛋白反应和ER相关降解之间的基本协调。单元格。2000年；101(3):249–258.-公共医学
    1. Biederer T，Volkwein C，Sommer T。泛素蛋白酶体途径降解内质网膜不可分割成分Sec61p复合物的亚单位。EMBO J.1996；15(9):2069–2076.-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型

MeSH术语

LinkOut-更多资源