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.2013年1月23日；32(2):303-14.
doi:10.1038/emboj.2012.335。 Epub 2013年1月4日。

APC/C-Cdc20复合物对Nek2A和Kif18A时间降解的控制机制

加里·塞奇威克 1, 丹尼尔·海沃德, 芭芭拉·迪·菲奥雷, 梅赛德斯·帕尔多, 陆羽, 乔纳森·派恩斯, 雅各布·尼尔森
附属公司

APC/C-Cdc20复合物对Nek2A和Kif18A时间降解的控制机制

加里·塞奇威克等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

后期促进复合物/环体（APC/C）与其共激活剂Cdc20的复合物负责靶向蛋白质，以实现有丝分裂期间泛素介导的降解。APC/C-Cdc20的活性在前中期被主轴组件检查点（SAC）抑制，但某些底物逃脱了这种抑制。Nek2A在前中期的降解取决于Nek2A通过C端MR二肽与APC/C直接结合，但仅此基序是否足够尚不清楚。这里，我们确定Kif18A是一种新型APC/C-Cdc20基底，并表明Kif18A的降解依赖于C端LR基序。然而，与Nek2A相比，Kif18A在后期才降解，这表明其他机制有助于Nek2A-降解。我们发现，通过亮氨酸拉链和MR基序进行二聚化，是APC/C与Nek2A和有丝分裂检查点复合体（MCC）稳定结合和泛素化所必需的APC/C亚单位的结合要求重叠，我们建议Nek2A与apo-APC/C具有高亲和力，并被Cdc20池降解，以避免SAC的抑制。

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数字

图1
图1
Kif18A通过C端LR基序结合APC/C。(A类)APC/C复合物使用来自诺克唑滞留细胞或诺克唑释放到MG132的细胞的APC4抗体亲和纯化2 h.用银染法分析样品的一部分，用质谱法分析剩余样品。(B类)显示了人类Nek2A、Cdc20、Cdh1和Kif18A最后六个氨基酸的氨基酸序列。(C类)用诺卡唑和用APC4抗体纯化的APC/C复合物阻止表达FLAG标记的Kif18A或Kif18A-ΔLR的稳定HeLa细胞株。通过FLAG印迹分析Kif18A蛋白的结合。(D类)向G2的HeLa细胞注射表达Venus–Kif18A或Venus-Kif18ΔLR融合蛋白的质粒，然后通过延时显微镜记录DIC和Venus信号，每3个 最小值(E类)测量并绘制了每个结构的金星总荧光。每个融合蛋白至少分析五个细胞。
图2
图2
Kif18A被APC/C–Cdc20复合物泛素化。(A类)用对照RNAi寡核苷酸或Cdh1 RNAi少核苷酸处理稳定的表达FLAG–静脉标记Kif18A的U2OS细胞系，并通过延时显微镜每4小时记录一次细胞有丝分裂过程，对细胞进行分析 在每个时间点对总Venus荧光进行定量，并显示每个条件下五个细胞的平均曲线。(B类)将对照缺失或Cdh1缺失的HeLa细胞从诺克唑块中释放出来，并在指定的时间点采集样本，通过western blot分析指定蛋白的水平。(C类)将控制缺失或Cdc20缺失的HeLa细胞从诺克唑块中释放出来，接种到含有DMSO或10的新鲜培养基中 μM RO-3306和在指定时间点采集的样品，并通过western blot进行分析。(D类)用紫杉醇（100 ng/ml），适用于16 h和5 μM MG132添加2 h带或不带3 μM ZM447439和有丝分裂振荡收集的细胞。使用APC4抗体纯化APC/C，并用于在体外用35S-蛋氨酸标记（35S-met）Kif18A或Kif18A-ΔLR作为底物的连接酶分析。结扎的程度由放射自显影术确定，显示高暴露和低暴露。通过对反应的一小部分进行western blot分析，平行测定APC4和BubR1水平。
图3
图3
Nek2A的C端可以在活动检查点期间以Kif18A为目标进行降级。(A类)分析了Nek2A一级序列示意图和截断构造。(B类–E类)通过延时显微镜分析表达所示蛋白的稳定U2OS/FRT/TRex细胞系，并在所示时间间隔记录DIC和Venus信号。测定每个时间点的总荧光，并在图中根据峰值强度指示，峰值强度设置为1。在两个独立的实验中，对每个融合蛋白至少五个细胞进行了分析，并显示了代表性曲线。(B类)维纳斯Nek2A WT(C类)维纳斯Kif18A-Nek2A 370-445(D类)维纳斯Kif18A Nek2A 435–445(E类)维纳斯内克2A 370-445。
图4
图4
前中期的Nek2A降解需要亮氨酸拉链和MR基序。(A类–F类)通过延时显微镜分析表达所示Nek2A蛋白的稳定U2OS/FRT/TRex细胞系，并在所示时间间隔记录DIC和Venus信号。测定每个时间点的总荧光，并在图中根据峰值强度指示，峰值强度设置为1。在两个独立的实验中，对每个融合蛋白至少五个细胞进行了分析，并显示了代表性曲线。(A类)维纳斯Nek2A KEN/AAA(B类)维纳斯Nek2AΔMR(C类)维纳斯内克2A 333–345(D类)维纳斯Nek2A 301–445(E类)维纳斯Nek2AΔ310-325(F类)维纳斯涅克2AΔ325–340。
图5
图5
当纺锤体检查点激活时，Nek2A必须通过其亮氨酸拉链二聚化以与APC/C结合。(A类)HeLa细胞瞬时转染500 所示FLAG–Venus–Nek2A或Kif18A融合表达结构的ng，并通过200 诺卡唑18 ng/ml h.使用抗APC4抗体对APC/C进行免疫沉淀，并用FLAG抗体探测印迹，以测定特定FLAG-Venus融合蛋白的结合。(B类)HeLa细胞瞬时转染1 μg指定的FLAG–Venus–Nek2A表达结构，用诺卡唑治疗18 h，然后通过摇动收集。使用抗APC4抗体对APC/C进行免疫沉淀。用FLAG抗体检测Nek2A蛋白的结合，然后由Licor定量。(C类)根据APC7和FLAG输入标准化后，比较指示的FLAG–Venus–Nek2A蛋白与APC/C的结合的条形图。(D类)用越来越多的FLAG–Venus–Nek2A WT或L313/L320A表达结构瞬时转染HeLa细胞，并用诺卡唑治疗18 h.用抗APC4进行APC/C免疫沉淀后，使用抗FLAG抗体测定FLAG–Venus–Nek2A结合。(E类)标准化至APC7水平后，比较Nek2A WT和Nek2A-L313A/L320A之间相对结合的条形图。(F类)使用GFP-Trap珠纯化所示FLAG–Venus–Nek2A融合蛋白1 h、 Licor使用抗Myc、抗APC1和抗APC7抗体测定Myc–Nek2A或APC/C的结合。(G公司)归一化至FLAG–Venus–Nek2A水平后，Myc–Nek5A、APC1和APC7与FLAG–Vanus–Netk2A WT、Nek2A-L313A/L320A或Nek2A-Δ310-325的相对结合。数据为平均值±标准差(n个=3），FLAG–Venus–Nek2A WT设置为1。(H（H）)Venus Nek2A WT、Venus Nek2A L313A/L320A和Nek2A-Δ325–340的代表性降解曲线。对来自两个独立实验的10个细胞进行Nek2A L313A/L320A分析。
图6
图6
Nek2A在前中期与apo-APC/C结合。(A类)用诺卡唑（200 ng/ml）18 h和5 2μM MG132 h.加载了越来越多的每个IP。用指示的抗体对斑点进行检测，并由Licor进行定量。在每条车道上方，相对于APC1、APC4、APC7和Nek2A的最大信号，指示信号的相对量。(B类)U20S细胞治疗18 h与诺卡唑（200 纳克/毫升）。通过摇晃收集有丝分裂细胞，并在诺康唑±5中孵育 2μM MG132 用抗APC4抗体纯化APC/C，用抗Nek2抗体检测共免疫沉淀内源性Nek2A。
图7
图7
Nek2A和MCC需要TPR亚单位与APC/C结合，并在APC8上共享一个共同的结合位点。(A类)在HeLa细胞上进行双重敲除法以耗尽所示APC/C亚单位。在双胸苷同步化后，细胞被释放到诺卡唑（200 ng/ml）。使用抗APC4或抗APC3抗体对APC/C进行免疫沉淀，并用指示的抗体检测印迹，并由Licor定量。APC11水平用于确定APC2耗竭是否有效。(B类)条形图，其指示在用所指示的siRNA处理后与抗APC3免疫沉淀物结合的MCC或Nek2A的量。Licor对斑点进行量化，并根据APC3水平进行标准化。两个独立实验的平均值，其中每个独立实验的单个值用一条线（APC2、APC6、APC8）表示，误差条表示四个独立实验（APC10）的平均值±s.d。(C类)作为(B类)但在APC4免疫沉淀和APC4水平正常化后显示MCC和Nek2A结合。两个实验的平均值，其中每个独立实验的单个值用一条线表示（APC2、APC6、APC8），误差条表示四个（APC3、APC10）实验的平均±s.d。(D类)用指示的siRNAs处理稳定表达FLAG–APC8 WT或FLAG–APC8 N338A的HeLa细胞，与双胸苷块同步，并释放到诺可唑（200 纳克/毫升）+5 μM MG132±强力霉素（20 ng/ml）然后在18后通过摇晃收集 h.使用抗APC4抗体免疫沉淀APC/C复合物，并使用Licor定量MCC或Nek2A结合。(E类)指示与APC4水平标准化后MCC或Nek2A结合水平的条形图。绑定到FLAG–APC8 WT设置为1。四个实验的误差线，平均值±标准差。
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