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.2013年3月；24(5):659-67.
doi:10.1091/mbc。E12-10-0721。 Epub 2013年1月2日。

Fis1、Mff、MiD49和MiD51介导线粒体裂变中的Drp1募集

奥利弗·洛森 1, 知音歌, Xiuchen Chen先生, 大卫·C·陈
附属公司

Fis1、Mff、MiD49和MiD51介导线粒体裂变中的Drp1募集

奥利弗·洛森等。 分子生物学细胞. 2013年3月.

摘要

一些线粒体外膜蛋白——线粒体裂变蛋白1（Fis1）、线粒体裂变因子（Mff）、49和51 kDa的线粒体动力学蛋白（分别为MiD49和MiD51）——被提出通过招募GTPase动力相关蛋白1（Drp1）来促进线粒体裂变，但关于其功能的基本问题仍然存在。最近的一项研究支持Mff的这种作用，但不支持Fis1。此外，还不清楚MiD49和MiD51是否激活或抑制裂变，因为它们的过度表达会导致线粒体广泛伸长。还不清楚这些蛋白质是否可以在彼此不存在的情况下起作用，以介导裂变。使用Fis1-null、Mff-null和Fis1/Mff-null细胞，我们表明Fis1和Mff都在线粒体分裂中起作用。此外，Drp1的免疫荧光分析表明，Fis1和Mff对线粒体上Drp1点的数量和大小很重要。最后，我们发现MiD49或MiD51都可以在没有Fis1或Mff的情况下介导Drp1募集和线粒体分裂。这些结果表明，多个受体可以招募Drp1来介导线粒体分裂。

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数字

图1：
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线粒体伸长图1-空，Mff公司-null，以及Fis1/Mff公司-无效的MEF。（A） 野生型和突变细胞的线粒体形态。通过对Tom20的免疫荧光观察线粒体。比例尺，10μm。插入比例尺，5μm。（B） 所示细胞系的线粒体网络形态评分。每个细胞被分为四种形态类别之一***第页< 0.001, **第页< 0.005, *第页< 0.02. （C） 形态分析。采用细胞外周的良好溶解线粒体（Tom20）进行形态计量分析。测量线粒体总数量和面积；这两个值的比值绘制为野生型的百分比。分析了来自两个独立实验的20个ROI。误差线，SEM*第页< 0.0001. （D） FRAP分析。对于每个指示的细胞系，该图显示了光漂白后10 s内的荧光恢复。每200 ms后漂白收集一次荧光数据。（E） FRAP数据的端点分析。显示了漂白后10 s的荧光恢复±SEM。对于D和E，平均20个FRAP试验**第页< 0.001, *第页< 0.01. （F、G）图1-null（F）和Mff公司-用Fis1、Mff或空白对照载体的表达构建物瞬时转染空白（G）细胞。细胞被分为四种形态类型之一。F、 碎片化<50，<50%的线粒体是长小管；>50，>50%的线粒体为长小管；N、 像网一样**第页< 0.005, *第页< 0.05. 将代表线粒体最短的细胞的F类和<50类结合起来进行统计检验。（H）用50μM CCCP处理所示细胞系的细胞1h，100μM足叶乙甙处理5h，1%O224小时，或0.1%血清3天。直方图显示线粒体碎片或大多为短管状的细胞百分比。对于B、F、G和h，数据是三个独立实验的平均值±SEM，每个实验得分100个细胞。所有统计测试都是用学生的t吨测试。
图2：
图2：
线粒体上的Drp1募集和组装在图1-null和Mff公司-空单元格。（A） 所示细胞系中的Drp1 puncta。为了提高线粒体Drp1的可视化，细胞在固定前用0.001%洋地黄素短暂处理，以降低细胞溶质Drp1水平。针对Tom20的免疫荧光显示线粒体。比例尺（左），10μm。方框区域的中间和右侧放大图像。比例尺，5μm。右侧面板中，将对应于线粒体通道的掩模应用于Drp1通道，以仅获得线粒体Drp1荧光。热图反映了Drp1荧光强度（FI）。（B） 线粒体Drp1点密度。（C） 每个点的Drp1荧光。在B和C中，数据被标准化为野生型控制。误差线，SEM。分析每组10至12个细胞的25个ROI*第页< 0.05, **第页< 0.005. 使用学生的t吨测试。（D） Drp1向线粒体募集。从所示MEF细胞制备细胞溶胶和纯化的线粒体部分，并通过Western blotting分析Drp1、Tom20（线粒体标记）和β-微管蛋白（TUBB；细胞溶质标记）。线粒体通道的细胞当量是细胞溶质通道的30倍。提供了Drp1印迹的短时间和长时间暴露。
图3：
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击倒米德49或MiD51型导致线粒体伸长并增强图1-空，Mff公司-null，以及Fis1/Mff公司-无表型。（A） 用对照siRNA处理的野生型MEF的线粒体形态米德49，siRNA对抗MiD51型或两者兼而有之。比例尺，10μm。插图是方框区域的放大图像。比例尺，5μm。Cox8-DsRed的表达突出了线粒体。（B） 含有单一和双敲除MiD的细胞裂解物的Western blot。SOD2是一种加载控制。（C） 野生型敲除实验线粒体网络形态评分，图1-空，Mff公司-null，以及Fis1/Mff公司-空单元格。数据来自三个独立的实验，每个实验有100个细胞得分。误差线，SEM.C，坍塌；五十、 长；N、 网状；S、 短。
图4：
图4：
MiD49或MiD51的过度表达导致S637上Drp1的磷酸化增强。（A） 增加Drp1 S637-PO4在过度表达MiD49或MiD51的细胞中。顶部，通过蛋白质印迹分析来自对照HeLa细胞或表达MiD49-Myc或MiD51-Myc的HeLa细胞的裂解物的Drp1和Myc标记的MiD。底部，Drp1被免疫沉淀，并且Drp1 S637-PO的水平4用磷酸特异性Drp1抗体检测。Drp1被用作免疫沉淀样品的负荷控制。（B） Drp1 S616-PO系列4过表达MiD49或MiD51的细胞中的水平。通过Western blotting对表达MiD49-Myc或MiD51-Myc的对照HeLa细胞或HeLa电池的裂解液进行Drp1、Drp1 S616-PO的分析4和Myc-tagged MiD.肌动蛋白被用作加载控制。（C） 增加Drp1 S637-PO4过度表达MiD49或MiD51的细胞向线粒体募集。从指示的HeLa细胞制备顶部、胞浆和粗线粒体部分，并通过Western blotting分析Drp1、超氧化物歧化酶2（SOD2；线粒体）和β-微管蛋白（TUBB；胞浆）。线粒体通道的细胞当量是细胞溶质通道的20倍。最后，线粒体部分的负荷归一化为总Drp1水平。Drp1 S616-PO的相对水平4和Drp1 S637-PO4用磷酸特异性抗体进行Western blotting检测线粒体。在A–C中，对S616-PO进行密度测定4和Drp1 S637-PO4并归一化为每个样本中的总Drp1。值以野生类型的比例表示。（D） MiD49和MiD51与Drp1的磷酸突变体的结合。如图所示，用Myc标记的MiD和Drp1突变体共同转染293T细胞。细胞用交联剂处理并溶解。Top，裂解物中Drp1和Myc-MiD的表达。底部面板，分析抗Myc免疫沉淀物的Drp1。请注意，该分析仅检测转染的Drp1（比较通道2、3-7和10）。A、 磷酸缺失突变体；D、 拟磷酸突变体；S、 野生型Drp1。
图5：
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线粒体伸长和Drp1 S637-PO增加4由MiD过度表达引起的反应可以被CCCP逆转。（A） 减少Drp1 S637-PO4CCCP处理的细胞中的水平。左边，通过蛋白质印迹法分析来自对照HeLa细胞或表达MiD49-Myc或MiD51-Myc的HeLa电池的裂解物。用二甲基亚砜（DMSO；用D表示）或CCCP（用C表示）处理细胞。右侧，Drp1 S637-PO4如图4A所示进行分析。Drp1 S637-PO的短期和长期曝光4给出了印迹。（B） Drp1 S616-PO系列4CCCP处理的细胞中的水平没有变化。如图4B所示，分析来自表达MiD49-Myc或MiD51-Myc的对照HeLa细胞或HeLa电池的裂解液。用DMSO（用D表示）或CCCP（用C表示）处理细胞。对S616-PO进行密度测定4和Drp1 S637-PO4印迹，并标准化为每个泳道中的总Drp1。数值表示为各组CCCP/DMSO数值的比值。（C） CCCP逆转MiD-过度表达MEF中的线粒体伸长。用MiD49-Myc或MiD51-Myc转染细胞，然后用载体（DMSO）或CCCP处理。用Myc免疫荧光法鉴定MiD表达细胞，用Tom20免疫荧光法观察线粒体。在DMSO处理的样品中，请注意MiD-Myc的表达会导致线粒体伸长。在CCCP处理的样品中，注意到表达MiD-Myc的细胞有破碎的线粒体。比例尺为10μm。（D） 转染MiD49-Myc、MiD51-Myc或空载体并用DMSO或CCCP处理的MEF线粒体网络形态评分。数据来自三个独立的实验，每个实验都有100个细胞得分。误差线，SEM.C，坍塌；五十、 长；N、 网状；S、 短。
图6：
图6：
MiD49和MiD51可以恢复CCCP诱导的线粒体断裂Fis1/Mff公司-空单元格。（A） 恢复中的Drp1 puntaFis1/Mff公司-空单元格。Fis1/Mff公司-用MiD49-Myc、MiD51-Myc或空载体转染空白细胞。分析细胞的MiD-Myc表达（抗Myc）、线粒体形态（Cox8-Dendra2）和Drp1。比例尺，10μm。右，放大的装箱区域图像。比例尺，5μm。（B） 线粒体上Drp1点密度。每组8-10个细胞中分析20个ROI。数据被标准化为野生型单元格。误差线，SEM*第页< 0.001. DM、，Fis1/Mff公司双突变体。（C） 线粒体网络形态评分Fis1/Mff公司-用MiD49-Myc、MiD51-Myc或空载体转染的空细胞，并用DMSO或CCCP处理。数据来自三个独立的实验，每个实验都有100个细胞得分。误差线，SEM.C，坍塌；五十、 长；N、 网状；S、 短**第页=0.002*第页= 0.02. （D） 代表性显微照片Fis1/Mff公司-转染MiD49-Myc或MiD51-Myc并用DMSO或CCCP处理的空细胞。对表达MiD-Myc的细胞进行线粒体形态分析（Tom20）。在CCCP治疗中，请注意MiD-Myc转染的细胞具有破碎的线粒体，而非转染细胞对CCCP诱导的破碎具有抵抗力。比例尺，10μm。使用学生的t吨测试。
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