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.2012年12月27日；2（6）：1670-83。
doi:10.1016/j.celrep.2012.11.024。 Epub 2012年12月20日。

泊松RNA聚合酶II随发育时间变化并为未来表达准备基因

比约恩·盖特纳 1, 杰夫·约翰师顿, 陈凯（Kai Chen）, 尼娜·瓦拉斯切克, 阿里尔·保尔森, 亚历山大·加鲁斯, 卡林·高登兹, 博尼·德库马尔, 罗布·克鲁姆洛夫, 朱莉娅·泽特林格
附属公司

泊松RNA聚合酶II随发育时间变化并为未来表达准备基因

比约恩·盖特纳等。 单元格代表. .

摘要

泊松RNA聚合酶II（Pol II）主要存在于发育控制基因中，被认为可以对细胞外信号进行快速同步诱导。在发育过程中平衡RNA Pol II的招募是如何调节的尚不清楚。通过在五个分化阶段从果蝇胚胎中分离肌肉组织，我们表明稳定的Pol II在许多基因中从头开始招募，这使得它们对未来的基因表达具有许可性。与其他组织的比较表明，这些变化是阶段特异性的，而不是组织特异性的。相反，Polycomb组阻遏是组织特异性的，与Pol II（平衡状态）结合可标记高度动态表达的基因。这表明，稳定的Pol II是临时调节的，并以特定组织的方式进行控制。我们将我们的数据与哺乳动物胚胎干细胞的发现进行了比较，并讨论了基于染色质状态预测发育程序的框架。

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数字

图1
图1。染色质和转录的组织特异性时间进程分析的实验策略
（A）实验程序概述。在感兴趣的组织中表达GFP的胚胎被分解成单个细胞。GFP阳性细胞通过FACS分离，并通过ChIP-seq和mRNA-seq进行分析。自肌细胞增强因子2-Gal4驱动的GFP在胚胎肌肉组织中的表达仅在6小时AEL后才明显，使用收费10b由中胚层前体细胞组成的突变胚胎原位扭转杂交）。另请参见图S1。（B）基因组浏览器截取了Pol II占用率的动态变化两个和57B法案肌肉发育过程中的基因。注意，这些变化与观察到的基因表达变化相关就地杂交和mRNA-seq（C）。（C）mRNA-seq数据的热图（左）。通过欧几里得距离对12786个个体基因的重复实验的时间进程数据进行聚类。色标反映了它们在RPKM中的表达水平。基于峰值mRNA，我们估计RPKM值为1，对应于0.5–1转录物/细胞（参见扩展实验程序）。特征明确的肌肉基因（右）的表达时间与这些基因的功能一致。另请参见图S1。
图2
图2。在开发过程中，对已准备就绪的Pol II的招募进行动态调节
（A）Pol II状态的定义。失速Pol II是指基因转录起始位点（TSS）的Pol II占有率高于转录单位（TU）的PolII占有率。Poised Pol II由高Pol II定义TSS公司浓缩（前20名第个mRNA-seq测定的低表达（RPKM<10）。（B）在这段时间内，对准备就绪的Pol II的招募进行动态调整。TSS的Pol II占有率显示了所有基因（n=1434）在时间进程中至少一个时间点保持Pol II平衡的时间。这些基因中有60%（n=867）始终被Pol II占据，而40%在Pol II是否占据之间切换。大多数切换状态的基因在第一个时间点缺乏Pol II占有率，并在时间过程中逐渐获得Pol II的占有率（开放集，n=502），而只有少数基因（封闭集，n=65）最初被Pol II占据并随后丢失。（C）来自三个时间窗口的全胚胎DNA酶超敏反应（DHS）数据（数据来自（Thomas et al.，2011））表明，随着时间的推移，DNA酶可及性增加，这与启动子开放和Pol II招募一致。（D）每个参考时间点在另一个时间点诱导的稳定基因的分数（准确率）（灰框；n是稳定基因的总数）。请注意，来自常量集的稳定基因在过去和未来都会表达，而来自开放集的基因往往只在未来被诱导。（E）对于参考时间点缺少Pol II的基因，进行了与（D）中相同的计算。（F）D和E的两个百分比之间的比率是相对预测值，它表明平衡基因比不含Pol II的对照基因更容易被激活。星号表示p<0.05。另请参见图S2。
图3
图3。Poised Pol II预测阶段特异性而非组织特异性基因表达
（A）肌肉和神经元之间10–12小时Pol II ChIP-seq和信使核糖核酸seq在10–12小时肌肉中平衡的基因的比较。10–12小时肌肉样本中的所有基因在10–12 h神经元中也有Pol II结合。许多（49%）在10-12小时肌肉中平衡的基因不仅在10-12 h神经元中与Pol II结合，而且也表达。（B）分析就地常量集和开放集的基因表达。正如预期的那样，常量集中的基因在所有发育阶段都得到了丰富，而开放集基因在发育过程中表达较晚（阶段13-16）。这两个基因集都不是肌肉特异性的，而是在中枢神经系统和上皮组织中表达丰富的。（C）组织特异性样本和整个胚胎的恒定集和开放集中平衡Pol II的相对预测值。在肌肉参考时间点具有稳定Pol II的基因不仅在肌肉中表达，而且在神经元或整个胚胎中表达，这表明Pol II募集不是组织特异性的。请注意，常数集的值在整个胚胎时间过程中具有强烈的阶段特异性，并且开口集在整个早期胚胎中不表达。有关计算，请参见图2。星号表示显著性（p<0.05），虚线框强调参考时间点。另请参见图S3。
图4
图4。不同的核心促进者与不同的Pol II占用行为相关
（A）)核心启动子元件在不同基因群中的富集。星号表示富集（黄色）或耗尽（黑色）显著（p<0.05）。首先，管家基因，根据以下定义在整个胚胎中广泛表达：就地杂交（Tomancak et al.，2007）富集了Ohler1、Ohler6、Ohler 7和DRE，这是在分散的启动子中发现的。注意，母体表达的基因在这里被视为“管家基因”，尽管它们可能不在胚胎中表达。第二，具有稳定Pol II（开放集，常数集）配置的基因富含GAGA、Inr、DPE、PB和MTE，这些基因存在于聚焦启动子中。常数集也丰富了一些分散的启动子元件，可能是因为其较高的平均表达（未显示）。平衡调节组和非平衡调节组是在具有或不具有先前的平衡Pol II的情况下在最后一个时间点诱导的基因。第三，非噪声调控基因富含Inr和TATA，因此具有支持集中转录的不同核心启动子配置。富含TATA-的基因因内务管理和发育功能而耗尽（未显示）。（B）三类启动子的平均核小体轮廓（顶部）和预测核小体占有率（中部）不同。对于每个类别，在Pol II存在和不存在的情况下分析MNase-seq测量的核小体轮廓（如下图所示）。只有具有稳定的Pol II的基因在没有Pol II时倾向于具有显著的启动子核小体，但在Pol II存在时则没有（星号，p值<10−48Wilcoxon秩和检验为+16 bp）。此外，家政基因在第一核小体（星号，Wilcoxon秩和检验为+151 bp）的占有率往往高于稳定基因（p值<10−40)或富含TATA-的基因（p值<10−15). 根据Kaplan等人（2009年）计算每个基因组的平均预测核小体占有率。另见表S2。
图5
图5。PcG抑制预测组织特异性抑制
（A）肌肉和神经元之间H3K27me3水平不同的基因在这些组织之间的表达也不同。14–17小时肌肉细胞或神经元细胞的mRNA-seq数据显示为方框图（log2 RPKM），胡须为四分位范围。肌肉（深蓝色）或神经元（浅蓝色）中H3K27me3较高的基因有差异表达（Schierr-Ray-Hare检验，p值<0.018）。（B）基于就地杂交后，差异H3K27me3集合与胚胎发生期间任何时间点仅在肌肉或神经元中表达的基因显著重叠（y轴显示重叠百分比）（Fisher精确检验p<0.02）。（C）肌肉和神经元之间H3K27me3水平差异的基因示例：扭曲(两倍）神经元中H3K27me3浓度较高（左）刮胡子(sv公司)肌肉中H3K27me3含量较高（右）。富集显示为H3K27me3读取超过输入读取，平滑超过100 bp窗口。（D）)在肌肉细胞中，与不含H3K27me3的基因相比，转录单位上高水平H3K17me3（所有基因中的前2.5%）的基因在未来诱导的可能性较小（左）。当我们预测神经元组织（中间）或整个胚胎（右）中的基因表达时，没有发现这种负预测值（蓝色），这表明抑制是组织特异性的。星号表示p<0.05；虚线框突出显示参考时间点。
图6
图6。期间平衡状态的行为果蝇属胚胎发生
（A）)针对H3K27me3和Pol II的连续ChIP证实了Pol II和H3K27me3在基因上的共现（上图）。与第一个ChIP相比，共现导致reChIP富集程度更高（输入过量测量并归一化为基因间控制区）。控制区富含Pol II，但不含H3K27me3(行动5C-TSS，RpL19-TSS)ChIP或reChIP均无明显富集。H3K27me3富集区缺乏Pol II(hbn-向上,gcm2以上)在Pol II reChIP之后出现下降。在平衡基因(opa-TSS系统,索引-TSS)相对K27me3 ChIP富集，reChIP富集增加。相反，使用H3K4me3（中间面板）或FLAG抗体（底部面板）检测reChIP时未观察到增加。显示了两到七个独立生物复制的平均值，误差条参考SEM。由于分析需要大量细胞，但不需要组织均匀性，因此在AEL 2-4小时对野生型胚胎进行了连续ChIP。星号表示p值<0.05，三个星号表示p值<0.001（t检验）。（B）为了分析Pol II和H3K27me3的全球共现性，我们对单个H3K26me3 ChIP和H3K27me3-Pol II reChIP进行了测序。结果证实，在全基因组水平上，第二次ChIP（y轴=log2Pol II ChIP−对数2H3K27me3 ChIP）在很大程度上取决于Pol II是否存在于基因中（根据单个Pol II ChIP分为无Pol II、低Pol II和高Pol II）。所示为方框图，胡须代表四分位范围，圆圈显示异常值。绝大多数Pol II高的基因在reChIP后表现出富集（p<10−32t检验）。（C）包含平衡基因的约320 kb基因组区域的基因组浏览器快照发票和恩（灰色框）。（D）在第一个时间点同时富集Pol II和H3K27me3的基因的时间进程分析。热图（左）表示Pol II和K27me3的相对富集度及其各自的相对表达水平（0=无富集/表达，1=最高富集/表达）。折线图（右侧）显示了热图中四个簇中每个簇的中值水平。注意，表达水平随着时间的推移而降低，并与Pol II的占据呈正相关，与H3K27me3的富集呈负相关。参见图S4和表S3。
图7
图7。平衡状态类似于哺乳动物的二价结构域
（A-D）果蝇中缺乏二价结构域可以解释为在平衡基因中没有检测到H3K4me3水平。（A）在暂停和表达的基因中检测到显著的H3K4me3水平(两个例如，顶部）但不稳定的基因(Skl公司示例，底部）。（B）10–12小时内表达（实线）或平衡（虚线）基因的Pol II（蓝色）和H3K4me3（绿色）的平均基因分析果蝇属肌肉细胞证实平衡基因果蝇属H3K4me3缺乏显著水平（p<10−104对于H3K4me3，在表达基因和稳定基因的碱基位置+163处富集；Wilcoxon秩和检验）。（C）在小鼠胚胎干细胞中，表达（实线）或平衡（虚线）基因的Pol II（蓝色）和H3K4me3（绿色）的平均基因分析表明，平衡小鼠基因具有高水平的H3K4me3（p<10−6对于H3K4me3，表达基因和稳定基因在碱基+130处富集；Wilcoxon秩和检验）。（D）小鼠启动子中CpG岛的存在并不能解释稳定基因中H3K4me3的高水平，如Pol II（蓝色）和H3K4me3（绿色）在带有（实线）或不带（虚线）CpG岛屿启动子的稳定小鼠基因中的平均基因分析所示。（E）在维甲酸诱导的小鼠ES细胞分化过程中，平衡态的行为与二价态相似。如图2F所示，计算未来基因表达的相对预测值。平衡Pol II和H3K4me3都是未来基因表达的积极预测因子，但有更多的基因带有H3K4me3，平衡PolⅡ的预测更具阶段特异性。H3K27me3在约8小时前是一个负预测因子，在约24小时后是一个正预测因子。平衡基因（Pol II高于背景，H3K17me3，n=445）和二价基因（H3K4me3和H3K24me3，n=483）高度重叠（n=340）。另请参见图S5。
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