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.2012年12月15日;1(12):1215-25。
doi:10.1242/bio.20122840。 Epub 2012年10月4日。

控制mTOR向沙门氏菌液泡募集的细菌和细胞决定因素

附属公司

控制mTOR向沙门氏菌液泡募集的细菌和细胞决定因素

伊万·塔托利等。 Biol开放. .

摘要

细菌入侵导致由宿主膜损伤引起的急性胞质氨基酸(AA)饥饿状态的快速诱导。细菌诱导的AA饥饿反过来下调mTOR信号,同时触发自噬和依赖GCN2、eIF2α和ATF3的综合应激反应途径。在沙门氏菌感染的细胞中,我们现在证明宿主AA饥饿反应程序依赖于沙门氏菌致病岛(SPI)-1,其活性需要在感染早期破坏含沙门氏杆菌的液泡(SCV)。在后期(感染后3-4小时),mTOR向SCV表面的逐渐募集似乎与SPI-2的活性和SCV在细胞中的定位无关。相反,mTOR定位到SCV需要宿主AA转运体SLC1A5、SLC3A2和SLC7A5的活性,导致细菌从自噬中逃逸。这些结果扩大了我们对沙门氏菌感染细胞中AA饥饿反应机制的理解。

关键词:氨基酸饥饿;沙门氏菌;m任务大纲。

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利益冲突声明

竞争利益:作者没有竞争性的利益需要声明。

数字

图1。
图1.SPI-1依赖性SCV膜损伤导致早期宿主AA饥饿反应。
(A类B类)HeLa细胞感染野生型(WT)或ΔSPI-1/Inv沙门氏菌应变为2h或4h、 IF使用NDP52和LAMP2(A)抗体或mTOR和LAMP1(B)抗体进行分析。(C类)WT或ΔSPI-1/Inv感染HeLa细胞诱导AFT3和IL-8的qPCR分析沙门氏菌菌株。值是指s.e.m。n个 = 三。
图2。
图2 NDP52、p62和泛素的膜募集不受AA饥饿的影响。
HeLa细胞被感染沙门氏菌在正常的AA-富集DMEM培养基或AA-缺失培养基(KRB)中培养1h、 2个h或4h.接下来,使用NDP52、p62和泛素抗体固定细胞并通过IF进行分析。
图3。
图3 SCV的强制核周聚集对mTOR的招募没有影响。
用编码RILP-GFP的表达载体转染HeLa细胞,感染沙门氏菌对于2h或4h、 并且使用抗mTOR抗体通过IF鉴定mTOR亚细胞定位。
图4。
图4.AA饥饿反应沙门氏菌-感染细胞是SPI-2非依赖性的。
(A类)HeLa细胞感染野生型(WT)或ΔSPI-2沙门氏菌菌株4h、 IF使用抗mTOR和LAMP2抗体进行分析。(B类)HeLa细胞感染WT或ΔSPI-2沙门氏菌应变为1h或3h、 用所示抗体进行印迹分析。(C类)WT或ΔSPI-2感染Hela细胞诱导AFT3和IL-8的qPCR分析沙门氏菌应变。数值为平均值±标准误差。
图5。
图5 LNAA和L-谷氨酰胺在靶向SCV的mTOR中的重要作用。
(A类B类)将HeLa细胞置于补充有指定AA的AA缺失培养基(KRB)中,保持未感染(A)或感染沙门氏菌用于4h(B),并使用抗mTOR和LAMP2抗体进行IF分析。(C类)感染后显示针对SCV的mTOR的细胞百分比沙门氏菌在补充有各种AA或DMEM的AA-缺失培养基中。值是指s.e.m。n个 = 3. *P(P)<0.05, **P(P)KRB(−AA)过度感染<0.01。(D类)如图所示,将HeLa细胞置于各种最小培养基中(−AA、−AA/L-Leu、−AA/L-Gln、–AA/L-Gln+L-Leu),并感染沙门氏菌用于4h.2时h p.i.,培养基被移除并更换为额外的2个h.接下来,使用抗mTOR和LAMP2抗体固定细胞并通过IF进行分析。(E类)如图所示,HeLa细胞在各种培养基中培养,保持未感染或感染沙门氏菌用于4h、 用所示抗体进行印迹分析。在“DMEM”中KRB 2号机组h”条件下,细胞培养2DMEM中的h,然后将介质更改为KRB,再进行2次小时。
图6。
图6 LNAA转运体在靶向SCV的mTOR中的重要作用。
(A类)HeLa细胞未感染或感染沙门氏菌用于4h、 在存在或不存在LNAA转运体抑制剂D-苯丙氨酸(D-Phe)的情况下,使用抗mTOR和LAMP2抗体固定并通过IF分析。(B类)HeLa细胞被靶向扰乱序列或SLC7A5的慢病毒转导,未经刺激(CTR)或感染沙门氏菌用于4h、 IF使用抗mTOR和LAMP2抗体进行分析。(C类)用慢病毒转导HeLa细胞,靶向扰乱序列(Scr)、SLC1A5、SLC3A2或SLC7A5、左侧未刺激(CTR)或感染沙门氏菌用于4h、 用所示抗体进行印迹分析。
图7。
图7……SLC7A5的亚细胞定位沙门氏菌-感染细胞。
(A类)将编码Myc-SLC7A5的表达载体转染HeLa细胞过夜,并使用针对Myc和Golgin-97的抗体进行IF分析。(B类)HeLa细胞被感染沙门氏菌在没有或存在促进高尔基体解体的药物布雷费尔丁A的情况下,添加30HeLa细胞感染后min沙门氏菌,以避免细菌进入的潜在副作用。接下来,使用抗mTOR和LAMP2抗体固定细胞并通过IF进行分析。(C类)HeLa细胞感染沙门氏菌1的重量h或4使用针对高尔基标记蛋白Golgin-97和SLC7A5的抗体通过IF分析h(D类)HeLa细胞被感染沙门氏菌在缺乏或存在氯氰菊酯依赖性内吞抑制剂的情况下,Dynasore补充道30HeLa细胞感染后min沙门氏菌,以避免对细菌进入产生潜在的副作用。接下来,使用抗mTOR和LAMP2抗体固定细胞并通过IF进行分析。
图8。
图8.持续瞄准沙门氏菌SLC7A5沉默细胞中的自噬机制。
稳定表达GFP-LC3的MDAMC细胞,用靶向扰乱序列或SLC7A5的慢病毒转导,被感染沙门氏菌用于4h,荧光显微镜分析。

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引用人

工具书类

    1. Bakowski M.A.、Braun V.和Brumell J.H.(2008)。含有沙门氏菌的液泡:引导交通和筑巢生长。2022年至2031年交通量9 10.1111/j.1600-0854.200827.x-内政部-公共医学
    1. Benko S.、Magalhaes J.G.、Philpott D.J.、Girardin S.E.(2010年)。NLRC5限制炎症途径的激活。免疫学杂志。185、1681–1691 10.4049/jimmunol.0903900-内政部-公共医学
    1. 伯明翰C.L.,Brumell J.H.(2006)。自噬识别受损液泡中的肠内沙门氏菌血清型伤寒杆菌。自噬2,156-158。-公共医学
    1. 伯明翰C.L.、史密斯A.C.、巴考斯基M.A.、吉森T.、布鲁梅尔J.H.(2006)。自噬控制沙门氏菌感染,以应对含有沙门氏杆菌的液泡受损。生物学杂志。化学。28111374–11383 10.1074/jbc。M509157200型-内政部-公共医学
    1. 伯明翰C.L.、卡纳迪恩V.、古因E.、特洛伊E.B.、吉森T.、科斯特P.、希金斯D.E.、布鲁梅尔J.H.(2007)。单核细胞增生李斯特菌在宿主细胞定植过程中通过自噬逃避杀灭。自噬3,442–451。-公共医学