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临床试验
.2012年2月1日。
doi:10.1038/srep01002。 Epub 2012年12月19日。

PINK1介导的Parkin泛素样结构域磷酸化启动Parkin线粒体易位并调节有丝分裂

Kahori Shiba-Fukushima公司 1, Yuzuru Imai公司, Shigeharu吉田, 石滨靖国, 金尾富子, 佐藤志贺, Nobutaka Hattori公司
附属公司
临床试验

PINK1介导的Parkin泛素样结构域磷酸化启动Parkin线粒体易位并调节有丝分裂

Kahori Shiba-Fukushima公司等。 科学代表. 2012.

摘要

帕金森病基因PINK1和parkin分别编码激酶和泛素连接酶。基因产物PINK1和Parkin与线粒体自噬或有丝分裂有关。线粒体膜电位（ΔΨm）丧失后，PINK1通过一种非同寻常的机制将胞质Parkin募集到线粒体中，这是在有丝分裂中触发连续事件的初始步骤。本研究报告帕金泛素样结构域（Ubl）中的Ser65在ΔΨm去极化后以PINK1依赖性方式磷酸化。Ser65突变的引入表明，Ser65的磷酸化不仅是Parkin高效易位的必要条件，也是线粒体蛋白在有丝分裂中降解的必要条件。Parkin致病突变体的磷酸化分析也表明Ser65磷酸化不足以进行Parkin易位。我们的研究部分揭示了PINK1依赖性线粒体易位和Parkin激活作为线粒体自噬的初始步骤的分子机制。

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数字

图1
图1。PINK1-帕金依赖性磷酸化体内.
（a） PINK1-FLAG重量或KD/HA-Parkin/粉红色1−/−MEF标有[32P] 正磷酸盐，用30µM CCCP处理1.5小时。通过放射自显影术检测磷酸化帕金(32P） ●●●●。免疫沉淀HA-Parkin通过免疫印迹（WB）和抗Parkin检测。（b）PINK1-FLAG WT或KD/HA-Park/粉红色1−/−在指定的时间段内，使用或不使用30µM CCCP处理MEF。随后在Phos-tag凝胶上分离细胞裂解液，然后用抗PINK1或抗Parkin抗体（Phos-tag-WB）分离WB。Parkin和PINK1的磷酸化带经λPP处理后消失，从而证实其磷酸化带。线粒体Hsp60被用作负荷对照。（c） 内源性PINK1表达的抑制抑制Parkin磷酸化。用指示浓度的针对PINK1（Invitrogen）的隐形siRNA双链加或不加10µM CCCP处理稳定表达非标记Parkin的HeLa细胞1小时。显示了PINH1的长（LE）和短暴露（SE）印迹信号。肌动蛋白被用作加载控制。（d） 本研究中使用的截短PINK1突变体。假定线粒体靶向序列，1–34 aa；跨膜结构域，94-110aa；激酶结构域，156–509 aa。（e）Parkin磷酸化需要全长PINK1。粉红色1−/−稳定表达非标记Parkin的MEF被不同的PINK1结构体转染，该结构体带有C-末端FLAG-tags。用抗FLAG-HRP证实PINK1的表达。（f） 正常对照组和停车场6用Parkin转染纯合C388R突变的病例，并用或不用30µM CCCP治疗1 hr.（g）用CCCP处理的细胞高达60 min，如（b）所示，用不含CCCP的新鲜培养基进一步培养指定的时间段（冲洗）。
图2
图2。Parkin Ubl结构域中的Ser65在ΔΨm去极化后被磷酸化。
（a） Phos-tag Western blotting检测到Ser65的磷酸化。用Parkin WT和一系列丙氨酸突变体瞬时转染HeLa细胞以获得候选磷酸酯类，然后用或不用20µM CCCP治疗1 用Phos-tag Western blotting分析细胞裂解物。星号表示Parkin降解。（b）多种动物中围绕Ser65（用黑点标记）的氨基酸序列排列。左边的数字对应于Parkin蛋白的残数。（c） S65A突变延迟Parkin易位到PINK1 WT/GFP-Parkin去极化线粒体/粉红色1−/−MEF公司。用GFP-Parkin WT或其磷酸化突变体（S65A和S65E）逆转录导入的细胞在指定的时间段内用或不用30µM CCCP处理。分别用抗-GFP（绿色）和抗-Tom20（红色）观察GFP Parkin和线粒体。驻车信号也显示为单色图像。比例尺=10µm。（d） Parkin突变体的线粒体易位效率。PINK1重量/粉红色1−/−稳定表达GFP-Parkin WT、S65A或S65E的MEF按（c）处理。计算表达GFP-Parkin的细胞与Tom20信号完全重叠（完整，示例如右图所示）、部分重叠（部分）或非重叠（否）。数据表示三个实验的平均值±SE(n个=每个电池99–143个）**第页< 0.01, *第页< 0.05与.WT在每个时间点。
图3
图3。Parkin的致病突变体受到Ser65磷酸化的影响。
（a） Parkin蛋白图解说明本研究中使用的致病性突变体。Ubl结构域中的Ser65残基显示为黄色圆圈。戒指，指环图案；IBR，中间无名指域。（b） 使用Parkin WT和一系列致病性突变体进行Parkin的Phos-tag Western blotting和PINK1的Western blotting，如图2a所示。（c） CCCP处理后SH-SY5Y细胞中内源性Parkin也被磷酸化。经或不经10µM CCCP处理30和60的SH-SY5Y细胞的核后细胞裂解物 min分为富含线粒体（Mito）和细胞溶质（Cyto）组分。对这两个组分及其组合（Mito+Cyto）进行Phos-tag或正常Western印迹分析。如前所述，内源性PINK1在Mito组分中被分离。乳酸脱氢酶（LDH）和Tom20分别用作细胞溶质和线粒体标记蛋白。星号：假定为劈开的Parkin；点：非特异性带。
图4
图4。Ser65磷酸化影响随后的自噬反应。
（a） PINK1 WT线粒体外膜蛋白的CCCP依赖性降解/粉红色1−/−表达WT或GFP-Parkin突变形式的MEF。Mfn1、VDAC1和Tom20被用作线粒体外膜蛋白的标记物。Actin：加载控件。斑点：泛素化Mfn1。（b） CCCP依赖性线粒体蛋白降解的长期时间过程分析。表达GFP-Parkin S65A或S65E突变的细胞外膜蛋白降解受损。Hsp60被用作线粒体基质蛋白的标记物。（c） S65A和S65E突变在线粒体自噬过程中不影响蛋白酶体向线粒体的募集。粉红色1重量/粉红色1−/−用30µM CCCP处理表达WT或GFP-Parkin突变形式（绿色）的MEF 3或6 细胞用抗蛋白酶体亚单位α7型（α7，红色）染色。如S65E（CCCP 0 hr），与聚集的线粒体（箭头）重叠6 CCCP治疗后小时，不考虑基因型。获得了类似的结果3 CCCP治疗后小时。比例尺=10µm。（d） Parkin易位和激活模型。Parkin Ubl域掩盖了E3活性的C末端RING-IBR-RING（RBR）域。Ser65（P）的Parkin磷酸化事件与未知因子（？）结合，刺激Parkin的线粒体易位，使RBR结构域从Ubl结构域的自动抑制中释放出来。
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