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.2013年2月7日;33(2):e00023。
doi:10.1042/BSR20120104。

三肽基肽酶-1(TPP-1)缺陷成纤维细胞自发和氧化应激诱导线粒体断裂的不同分子机制

附属公司

三肽基肽酶-1(TPP-1)缺陷成纤维细胞自发和氧化应激诱导线粒体断裂的不同分子机制

纪尧姆·范·比塞尔等。 Biosci代表. .

摘要

NCL(神经元类蜡样脂褐质酶)由八种遗传性常染色体隐性疾病组成,其特征是自身荧光色素在溶酶体内积聚,称为蜡样体。最近的数据表明,NCL的发病机制与功能改变的线粒体碎片的出现有关。然而,即使自噬途径中的损伤经常被诱发,导致线粒体断裂以应对溶酶体功能障碍的分子机制仍不清楚。在本研究中,我们发现缺乏TPP-1(三肽基肽酶-1)的成纤维细胞,这是一种由LINCL(婴儿晚期NCL,CLN2型)突变基因编码的溶酶体水解酶,也表现出支离破碎的线粒体网络。这种形态学改变伴随着BNIP3蛋白(Bcl2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3)的表达增加,以及线粒体融合蛋白1和2的丰度降低。利用RNAi(RNA干扰)和线粒体形态定量分析,我们表明,抑制BNIP3表达不会导致LINCL细胞线粒体种群网状结构的增加。然而,这种蛋白似乎在细胞对线粒体氧化应激的反应中起着关键作用,因为它使线粒体对抗霉素a诱导的碎片敏感。据我们所知,我们的结果首次证明了TPP-1缺乏和氧化应激诱导的线粒体形态变化之间的联系。

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数字

图1
图1。对照成纤维细胞、LINCL细胞和负载重组TPP-1的LINCL中TPP-1活性
使用合成底物Ala–Ala–Phe–AMC(AAF–AMC),在存在(LINCL+TPP-1)或不存在(LINCL)10 nM重组TPP-1的情况下预培养48 h的CTL和LINCL细胞中测量TPP-1活性。简言之,在与重组酶孵育结束时,细胞在不含TPP-1的新鲜培养基中培养72小时。然后将细胞在冰镇等渗蔗糖中均质,并用Triton X-100溶解膜。在50 mM醋酸盐缓冲液(pH 5.0)中测定TPP-1活性,该缓冲液含有5 mM 4-甲基伞形花序基衍生物作为底物。在荧光分光光度计(λ不包括350纳米;λ相对长度单位,460纳米)。结果以蛋白质含量归一化的任意荧光单位(AFU/μg蛋白质)计算,并以CTL细胞百分比表示为平均值±S。D(n个=3). **, ***: 与CTL细胞显著不同P(P)<0.01和P(P)分别<0.001。###:与负载TPP-1的LINCL细胞显著不同P(P)通过ANOVA-1和Dunnett检验确定<0.001。
图2
图2。TPP-1缺乏对线粒体丰度的影响
(A类)用(LINCL+TPP-1)或不使用(LINCL)重组TPP-1预培养的LINCL细胞分析线粒体数量。然后用100nM MitoTracker Green对细胞染色30分钟,并通过流式细胞术检测荧光,如材料和方法部分所述。结果表示为MitoTracker绿色荧光MCFR,由相应未染色细胞的自荧光信号计算得出,并表示平均值±S。D(n个=3). NS,与学生确定的LINCL细胞无显著差异t吨测试。(B类)HADHA、ATPsynthaseβ亚基和mt-HSP70的丰度通过Western blot分析测定,该分析是在15μg透明细胞裂解液上进行的,这些透明细胞裂解物是由LINCL细胞(LINCL+TPP-1)与重组TPP-1预先孵育或未孵育(LINCL)制备的。通过免疫检测β-肌动蛋白或α-微管蛋白来控制相等的蛋白质负荷(n个=3). (C类)ATP合成酶β-亚基(灰柱)HADHA(白柱)和mt-HSP70(黑柱)丰度的定量(B类). 结果以α-微管蛋白或β-肌动蛋白的归一化荧光强度计算,并以LINCL细胞的百分比表示为平均值±S。D(n个=3). *: 与LINCL细胞显著不同P(P)<0.05,由学生确定t吨测试。
图3
图3。TPP-1缺陷对BNIP3表达的影响
(A类)在BNIP3引物和SYBR绿的存在下,从预先培养有(LINCL+TPP-1)或没有(LINCL)TPP-1的LINCL细胞中提取总RNA,通过实时RT-qPCR进行逆转录和扩增。GAPDH被用作数据归一化的参考基因。结果以LINCL细胞中测定的mRNA丰度百分比表示,并代表平均值±S。D(n个=3). *: 与LINCL细胞显著不同P(P)<0.05,由学生确定t吨测试。(B类)BNIP3的蛋白质丰度通过Western blot分析测定,该分析是在15μg透明细胞裂解物上进行的,这些透明细胞裂解液是由LINCL细胞预先与TPP-1孵育(LINCL+TPP-1)或未与TPP-2孵育的(LINCL)制备而成(n个=3). 通过α-微管蛋白的免疫检测控制等蛋白负荷。(C类)Western blot的定量(B类). 对α-微管蛋白相关带的荧光强度进行归一化,并表示为LINCL细胞的百分比。结果为平均值±S。D(n个=3). *: 与具有P(P)<0.05,由学生确定t吨测试。
图4
图4。TPP-1缺乏对线粒体形态的影响
(A类)与(CTL+FCCP)或不与(CTL)20μM FCCP预孵育30分钟的成纤维细胞和与(LINCL+TPP-1)或不与(LINCL)TPP-1预孵育并用100nM Mitotracker Green染色的LINCL细胞的线粒体形态的代表性共聚焦显微照片。(B类C类)线粒体(或FF)的长度(或AR)和分支程度使用ImageJ软件在显微照片上测定,如材料和方法部分所述。结果以任一AR表示(B类)或FF比率(C类)并表示平均值±S。E.M.公司(n个≥59来自四个独立实验)。###:与CTL细胞显著不同P(P)<0.001; *, ***: 与通过Mann-Whitney秩和检验确定的LINCL细胞的统计差异P(P)<0.05和P(P)分别<0.001。
图5
图5。BNIP3沉默对恢复TPP-1活性的LINCL和LINCL细胞线粒体形态的影响
(A类)siRNA-介导的LINCL细胞BNIP3敲除效率。BNIP3的丰度通过Western blotting分析确定,该分析是在15μg透明细胞裂解物上进行的,这些透明细胞裂解液是由未转染的LINCL细胞和转染了四个靶向BNIP3(siBNIP3)的特异性siRNA池或一个siRNA对照池(siCTL)的细胞制备的。通过α-微管蛋白的免疫检测控制等蛋白负荷。(B类)具有恢复TPP-1活性的LINCL和LINCL细胞线粒体形态的典型共焦显微照片,转染了一个siRNA对照池(siCTL)或一个针对BNIP3的四个特定siRNA池(siBNIP3),然后用100 nM Mitotracker Green染色。线粒体的长度(AR)和分支程度(FF)使用ImageJ软件在显微照片上测定,如材料和方法部分所述。结果以任一AR表示(C类)或FF比率(D类)平均值±S。E.M.公司(n个≥50,来自三个独立实验)。*:与转染siCTL的LINCL细胞显著不同P(P)<0.05,分别通过ANOVA-2、Holm–Sidak检验和Mann–Whitney秩和检验确定AR和FF。NS与转染siCTL的LINCL细胞无显著差异。
图6
图6。TPP-1缺乏对线粒体动力学主要调节因子丰度的影响
(A类)用荧光Western blot分析15μg由LINCL细胞制备的透明细胞裂解物测定Opa1、Drp1、Mfn2、Mfn 1和Fis1的丰度,该透明细胞裂解液由预先孵育有(LINCL+TPP-1)或未孵育(LINCL)TPP-1的细胞制备(n个=3)。通过α-微管蛋白的免疫检测控制等蛋白负荷。星号表示非特定和无特征的带。(B类)图中所示印迹上Opa1(白色柱)、Drp1(灰色柱)、Mfn2(阴影线)、Mfn1(点)和Fis1(黑色柱)丰度的量化(A类). 结果以α-微管蛋白的标准化荧光强度计算,并以LINCL细胞的百分比表示为平均值±S。D(n个=3).*:与LINCL细胞显著不同P(P)<0.05,由学生确定t吨测试。
图7
图7。免疫荧光共聚焦显微镜观察Drp1/Fis1的细胞分布和这些蛋白的共定位
(A类)共焦显微镜拍摄的Drp1和/或Fis1免疫染色的代表性显微照片。LINCL细胞在盖玻片上培养,在固定、渗透和培养针对Fis1-(红色)或Drp1-(绿色)的抗体之前,与(LINCL+TPP-1)或不与(LINCL)TPP-1孵育。在合并的显微照片中,黄色荧光信号的出现反映了两种蛋白质之间的共定位。细胞核用TO-PRO-3碘化物染色(蓝色荧光)。(B类)使用徕卡LAS AF软件的联合定位模块量化Drp1和Fis1之间的联合定位。结果表示为共同定位的百分比(平均值±S.D。;n个=20). NS与LINCL细胞无显著差异,由学生的t吨测试。
图8
图8。TPP-1缺乏对线粒体膜电位、线粒体基质钙浓度和线粒体O的影响2•−内容
(A类)用特异性线粒体膜电位探针TMRE分析预先孵育有(LINCL+TPP-1)或未孵育(LINCL)重组TPP-1的LINCL细胞的线粒体膜电位。用25 nM TMRE对细胞进行染色或不染色(以便从没有染色的细胞中进行自体荧光测定)30分钟,并用流式细胞仪分析荧光。结果用TMRE荧光MCFR表示为平均值±S。D(n个=3),***:与具有P(P)<0.001,由学生确定t吨测试。(B类)线粒体O2•−使用特定线粒体MitoSOX™红色染料,在预先培养有(LINCL+TPP-1)或没有(LINCL)TPP-1的LINCL细胞中评估含量。用10μM MitoSOX™Red特异性染料对细胞进行10分钟染色(白色和灰色柱)或不染色(以便从没有染料的细胞中进行自体荧光测定),并使用荧光分光光度计(λ不包括485纳米;λ相对长度单位,520纳米)。作为阳性对照,用10μM抗霉素a(灰色柱)培养细胞15分钟,而未经处理的细胞保持15分钟,没有分子(白色柱)。将结果归一化为蛋白质含量,并以蛋白质的相对荧光任意单位/μg表示为平均值±S。D(n个=3). ***, ###: 与未经处理的LINCL和LINCL+TPP-1细胞分别存在显著差异P(P)<0.001,通过ANOVA-2和Holm-Sidak’s确定t吨测试。NS与LINCL细胞无显著差异。(C类)使用X-Rhod-5F(一种特殊的线粒体基质钙探针)测定预先孵育有(LINCL+TPP1)或没有(LINCL)重组TPP-1的LINCL细胞中的线粒体钙浓度。用2μM X-Rhod-5F荧光探针对细胞进行染色或不染色(以允许从没有染料的细胞中进行自发荧光测定)30分钟,并在荧光光谱仪中测量荧光强度(λ不包括580纳米;λ相对长度单位,612纳米)。为了测试线粒体钙缓冲能力,用10μM离子霉素培养细胞10分钟(灰色柱)、20分钟(深灰色柱)或30分钟(黑色柱)或不处理细胞(白色柱)。结果表示为相对荧光单位(RFU),用于归一化碘化丙啶(IP)染色测定的DNA含量,作为平均值±S。D(n个=9). ***, 与LINCL细胞显著不同,P<0.001,###:与LINCL+TPP-1细胞显著不同(通过Mann-Whitney秩和检验确定)。NS与LINCL细胞无显著差异。
图9
图9。BNIP3沉默对抗霉素A诱导LINCL细胞线粒体断裂的影响
(A类)恢复TPP-1活性的LINCL和LINCL细胞线粒体形态的典型共焦显微照片。在培养结束时,用四个靶向BNIP3的特异性siRNA池(siBNIP3)或一个siRNA对照池(siCTL)转染细胞24小时,用25μM抗霉素a培养1小时,最后在分析前加载100 nM Mitotracker Green。如材料和方法部分所述,使用ImageJ软件测定线粒体的长度(AR)和分支程度(FF)。结果以任一AR表示(B类)或FF比率(C类)平均值±S。E.M.公司(n个≥40来自三个独立实验)。**,***:与转染siCTL的LINCL细胞显著不同P(P)分别<0.01或0.001,由Mann-Whitney秩和检验确定。NS,无显著差异。NS与预先培养TPP-1并转染siCTL的LINCL细胞无显著差异。

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