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临床试验
.2012年12月27日；2(6):1554-62.
doi:10.1016/j.celrep.2012.11.017。 Epub 2012年12月13日。

β-微管蛋白基因TUBB5突变导致小头畸形伴脑结构异常

马丁·布劳斯 1, 朱利安·伊克·特森·亨, 卡琳·波里埃, 田国灵, 泽维尔·休伯特·贾林, 郑东区, 安德雷亚思·布劳恩, 托马斯·格斯特林, 林恩戈, 马蒂尔达·哈斯, 纳迪亚·巴希·布伊松, 玛丽·劳雷·穆塔德, 桑德琳·帕斯马尔, 阿兰·韦洛斯, 皮埃尔·格雷森, 谢云丽, 凯瑟琳·J·H·罗布森, 迪帕·塞尔维·拉尼, 库马拉萨米·桑加拉（Kumarasamy Thangaraj）, 蒂姆·克劳森, 杰梅尔·雪莉, 尼古拉斯·贾斯汀·考恩, 大卫·安东尼·凯斯
附属机构
临床试验

β-微管蛋白基因TUBB5突变导致小头畸形伴脑结构异常

马丁·布劳斯等。 单元格代表. .

摘要

哺乳动物皮层的形成需要神经元的产生、迁移和分化。微管细胞骨架在这些细胞过程中所起的重要作用体现在发现不同微管蛋白同质型的突变会导致不同的神经发育疾病，包括无脑症（TUBA1A）、多小脑回症（TUB1A、TUB2B、TUBB3）和眼球运动障碍（TUB3）。在这里，我们表明Tubb5在小鼠的神经原性祖细胞中表达，并且其体内耗竭会干扰祖细胞的细胞周期并改变迁移神经元的位置。我们报告了三例脑结构异常的小头畸形患者，其TUBB5（M299V、V353I和E401K）中存在新发突变。这些突变蛋白以不同方式影响微管蛋白异二聚体的伴侣依赖性组装，扰乱体内神经原性分裂和/或迁移。我们的结果提供了对微管蛋白基因家族的功能储备的见解，特别是在胚胎神经发生和小头畸形中涉及到TUBB5。

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数字

无
图形摘要
图1
图1
管5在发育中的小鼠和人脑中高度表达（A）通过定量实时PCR在E10.5、E12.5、E14.5、E16.5和E18.5以及出生后第0天（P0）和第6天（P6）（n=3）测定发育中小鼠脑中β-微管蛋白基因的相对表达水平。注意早期发病和持续高表达的管5（B）GW13和GW22发育中大脑中所有人类β-微管蛋白基因的相对表达水平。（C–H）用特异性反义探针获得的原位杂交结果管5E12.5（C和D）、E14.5（E和F）和E16.5（G和H）处。（D） （F）和（H）分别表示（C）、（E）和（G）的放大倍数较高。管5在整个发育中的皮层中都检测到，在E12.5的预板和E14.5的SVZ中都有强表达。在E14.5处的Tg（Tubb5-EGFP）小鼠系冠状切片上进行Dcx（I–L）、Tuj（M-P）、Tbr2（Q–T）和Pax6（U–X）抗体染色。（J）、（N）、（R）和（V）的灰度图像显示在（K）和（L）、（O）和（P）、（S）和（T）、（W）和（X）中。所有标记物均与GFP阳性细胞共定位。比例尺显示500μm in（C）、（E）和（G）；50μm英寸（D）、（F）和（H）；50μm英寸（U）；和10μm英寸（V）。（A）和（B）中的误差条显示SEM。另请参见图S1。
图2
图2
管5耗竭干扰祖细胞有丝分裂并改变有丝分裂后神经元的定位（A）图示三种不同的宫内电穿孔实验。在E14.5电穿孔后，36小时后收获胚胎以评估有丝分裂指数，72小时后收获以评估迁移指数，或在P17收获以评估定位指数。（B） 定量有丝分裂指数，显示在VZ和SVZ、IZ以及所有区域（Total）pH3阳性的GFP阳性细胞在以下条件下的相对比例：打乱的shRNA（scrshRNA）；shRNA靶向管5（shRNA）；过度表达管5（pCIG2管5); 和救援实验（pCIG2-管5+shRNA）。请注意管5与混乱对照、过度表达和拯救实验相比，耗竭导致有丝分裂指数显著增加（n≥5；VZ和SVZ：p<0.001；总计：p<0.05）。（C和D）有丝分裂指数实验的代表性图像。箭头突出显示GFP表达细胞（绿色）与pH3染色（红色）的共定位。（E和F）显示以下迁移评估的代表性图像管5消耗。注意到GFP阳性细胞达到CP的比例显著降低。（G）量化VZ、IZ、CP和边缘区（MZ）中GFP阳性的细胞百分比，以确定用scrshRNA处理后的迁移指数；shRNA靶向管5（shRNA）；一管5表达结构（pCIG2管5); 和救援实验（shRNA+pCIG2管5).管5耗竭导致位于VZ和IZ的GFP阳性细胞百分比适度但显著增加，CP中GFP阳性的细胞百分比减少（n≥5，VZ：p<0.05；IZ：p<0.05，CP：p<0.01）。这种表型部分被一种管5缺乏shRNA靶向序列的同型（pCIG2管道5+shRNA）。注意过度表达管5本身对迁移没有影响（pCIG2管5). （H） 用scrshRNA和shRNA靶向治疗后P17皮层六层GFP阳性细胞百分比的量化管5. 管5耗竭导致第VI层神经元百分比显著增加（n=4；p<0.05），同时第II–IV层神经元百分比也随之减少（n=5；p<0.01）。（I和J）（H）中定位索引的代表图像。红色通道显示第II–IV层Cux1染色。比例尺显示50微米in（D）、100微米in（F）和200微米in（J）。（B）、（G）和（H）中的误差条显示平均值±SEM。∗p<0.05，∗∗p<0.01，***p<0.001。MZ，边缘带；scrshRNA，加扰shRNA。另请参见图S2。
图3
图3
中的突变管箱B5导致小头畸形并影响两例患者不同方式（A–F）冠状（A和D）、矢状（B和E）和水平（C和F）MRI下Tubulin异二聚体的生成管箱B5-相关小头畸形（M299V和V353I）。（A–C）M299V突变患者有小头畸形（OFC为-2.5 SD）、局灶性多小脑回（A中箭头所示）、严重脑干发育不良（B中箭头所指）、胼胝体部分发育不全（B中图标所示），基底节形态异常，有白质条纹（用C中的箭头突出显示）。（D–F）V353I突变患者有小头畸形（OFC为−4.0 SD）、胼胝体发育不全（E中箭头所示）和基底节畸形，白色物质条纹穿过豆状核（F中箭头所指）。（G） 微管蛋白异二聚体的结构表征，突出了突变残基的位置。M299残留物位于中心位置，与深疏水囊有关。V353位于二聚体内界面，而E401位于二聚物间界面。（H–J）显示微管蛋白异二聚体三维结构内突变残基的高分辨率图像。（H） M299侧链被疏水残基包围（M267、P305、Y310、F367，以绿色显示），这些残基可能会被缬氨酸取代而破坏。（J） E401靠近一个环路（98–104，以绿色显示），该环路对GTP的绑定至关重要（以黄色显示）。（K） 体外变性凝胶35野生型和TUBB5突变体的S-蛋氨酸标记的转录/翻译反应产物显示出类似的翻译效率。（五十） 野生型和TUBB5突变体体外转录/翻译反应产物的非变性凝胶动力学分析。箭头（从上到下）表示伴侣蛋白（CCT）/β-微管蛋白二元复合物（CCT/β，每个都是根据其特征电泳迁移率进行分配的。请注意，V353I突变多肽的行为与野生型对照相似，而M299V的异二聚体产量降低，E401K的异二聚体产量很少或没有检测到。还应注意，在E401K突变的反应中，TBCA/β-微管蛋白和TBCD/β-微管蛋白复合物的缺失以及PFD/β-微管蛋白复合物的相对较长的持续时间。Min.chase表明，用添加的天然牛脑微管蛋白进一步追赶90分钟后产生的反应产物，以便在所示时间内驱动微管蛋白异二聚体的产生。（M–X）FLAG标记的野生型和突变体（M299V、V353I和E401K）TUB55在培养的Neuro-2a细胞中的表达。用抗FLAG抗体染色显示为红色，用抗α-微管蛋白抗体显示微管细胞骨架（显示为绿色）。请注意，野生型FLAG标记的TUBB5以及相应的M299V和V353I突变体并入微管晶格（分别为M–O、P–R和S–U）。这与E401K蛋白形成对比，E401K蛋白质分布在细胞质中，无法融入细胞骨架网络（V-X）。（X）中的比例尺为10μm。另请参见图S3。
图4
图4
疾病原因的表达管5体内突变（A）用控制载体（ctrl）电穿孔细胞有丝分裂指数的量化，A管5表达载体（pCIG2-管5; 注意，图2B中也显示了这种控制），并且识别了突变体（pCIG2-管5（M299V），pCIG2-管5（V353I），pCIG2-管5（E401K））。管5过度表达导致有丝分裂指数与对照组相当。相反，当表达E401K和V353I突变结构时，VZ和SVZ中的GFP阳性细胞（pH3阳性细胞）的百分比大幅增加（n≥5；E401K与V353I:VZ+SVZ:p<0.001；总数：p<0.000）。当M299V突变过度表达时，有丝分裂指数也明显增加，尽管这种影响在统计学上并不显著（n≥5；p>0.05）。（B） 所有五种情况下迁移指数的量化（注意管5过度表达控制也显示在图2G中）。突变体的过度表达导致了IZ中GFP阳性细胞的积聚，同时CP也随之减少（n=5；M299V:IZ:p<0.001；CP:p<0.01；V353I:VZ:p<0.01；IZ:p<0.001，CP:p<0.001；E401K:IZ:p<00.01；CP:p<0.05），这在过度表达时没有观察到管5单独用药（n=5，p>0.05）。（C–E）用于有丝分裂指数评估的代表性图像，箭头显示GFP表达细胞（绿色）与pH3染色（红色）共定位。（F–I）用于迁移评估的代表性图像。注意，与对照相比，当表达突变构建体时，到达皮层上层的细胞的相对数量减少(∗p<0.05，∗∗p<0.01，***p<0.001）。比例尺显示50微米in（E）和100微米in（I）。（A） 和（B）表示平均值±SEM。另见图S4。
图S1
图S1
图1的阴性对照和Tg（Tubb5-EGFP）小鼠品系（A–C）分析图1所示时间点（E12.5、E14.5、E16.5）原位杂交实验的阴性对照（感测探针）。（D–F）图1所示Tg（Tubb5-EGFP）胚胎的轻度控制，GFP转基因阴性。使用与（G）-（Q）中所示相同的设置拍摄图像；没有检测到背景荧光。（G–Q）所示时间点（E12.5、E14.5、E16.5）Tg（Tubb5-EGFP）胚胎的代表性冠状（G、I-K、M-O、Q）和矢状（H、L、P）切片。（一） 和（M）表示（G）和（K）中所示方框区域的放大倍数。发育中皮层的高倍共聚焦图像如（J）、（N）、（Q）所示。请注意，EGFP在整个发育中的皮层中都有稳健的表达，这与我们的原位研究一致。比例尺显示（A–C）、（G）、（H）、（K）、（L）、（O）和（P）为1000微米，（F）为500微米，（J）、（N）和（Q）为50微米。DAPI染色（以蓝色显示）可见于（G）、（H）、（K）、（L）、（O）和（P）。
图S2
图S2
图2补充信息和细胞凋亡评估（A）管5用pSuper载体转染Neuro2a细胞后，mRNA表达靶向该基因3′UTR的shRNA。这导致了以下因素的约62%的击倒（36小时）和约77%的击落（72小时）管5mRNA水平。误差条显示SEM（每个时间点3个独立实验）。（B和C）评估pCIG2电穿孔后神经元定位的代表性图像管5和pCIG2管5+shRNA.（D和E）用pCIG2电穿孔时有丝分裂指数评估的代表性图像管5和pCIG2管5+shRNA.（F–N）凋亡实验的代表性图像，显示GFP通道（F-H）、活化caspase-3染色（I-K）和合并图像（L-N）。F、I和L中的框体区域显示在相邻的面板（G、J、M）和（H、K、N）中。图H、K和N突出显示皮层的背中区作为胱天蛋白酶-3染色的内部阳性对照。H、K和N中的放大区域显示凋亡细胞对胱天蛋白酶-3呈阳性。（O） GFP+细胞与活化capase-3共定位的定量。所有条件都显示联合本地化不足1%。方差分析和多重比较测试显示相关实验（scrshRNA、shRNA、pCIG2）之间没有显著差异管5和pCIG2管5+shRNA；控制，pCIG2管5，pCIG2管5（M299V），pCIG2管5（V353I）和pCIG2管5（E401K））。比例尺显示50微米in（C）、100微米in（E）和200微米in（L）。
图S3
图S3
图3的补充信息（A–C）患者和父母的测序轨迹显示管箱B5用于M299V、V353I和E401K以及氨基酸转换。所有突变都是从头开始的。（D） 人类β-微管蛋白的蛋白质序列比对（上图）。请注意，除了TUBB1中的T299外，所有三个基因座的亚型之间高度保守，这是人类亚型中最独特的。下部面板显示了多种物种中TUBB5同源物的排列。请注意，这三种致病残基从酵母到人类是保守的。（E和F）携带E401K突变的患者在4个月大时拍摄的水平（E）和矢状（F）MRI图像。该患者表现为小头畸形（−4 SD OFC）、胼胝体后部部分发育不全和基底节畸形。
图S4
图S4
突变体Tubb5在体内表达后的定位指数，与图4（A–E）相关。P17小鼠大脑在E14.5子宫内电穿孔后的代表性图像，质粒表达：（A）扰乱shRNA；（B）管5重量；（C）管5m299伏，（D）管道5V353I和（E）管5E401K型。分析的皮层区域显示在A中。红色通道显示第II-IV层的Cux1染色。注意，当过度表达管5突变体（M299V、V353I、E401K）。（F） 所有五种情况下P17皮层I-VI层中GFP阳性细胞百分比的量化（注意，对照也在图2H中显示；另见表S2）。的过度表达管5突变导致皮质浅层细胞减少（M299V；II-IV：p<0.05，E401K；II-IV:p<0.001），深层GFP阳性细胞积聚（E401K，n=3；VI:p<0.01），但在V353I突变的情况下，这并不显著（n=3，p>0.05）。放大（C）、（D）和（E）中的方框区域，显示GFP阳性细胞异位聚集。请注意，这些细胞中有许多对有丝分裂后标志物Cux 1也呈阳性。∗p<0.05，∗∗p<0.01，***p<0.001。数据为平均值±SEM。比例尺显示（E）中的200μm和（I）中的100μm。
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