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.2012;7（11）：e50342。
doi:10.1371/journal.pone.0050342。 Epub 2012年11月30日。

GDF5调节乳腺癌MCF-7细胞中TGF依赖性血管生成：抗TGF肽的体内外控制

弗朗西斯卡·玛格丽 1, 尼古拉·斯齐亚沃尼, 劳拉·帕普奇, 露西娅·马格内利, 西蒙娜·塞拉特, Anastasia Chillá, 安娜·劳伦扎纳, 弗朗西丝卡·比安奇尼, 利多·卡洛里尼, 尤金尼奥·托雷, 哈维尔·多特, Esperanza Feijoo公司, 加布里埃拉·菲比, 马里奥·德尔·罗索
附属机构

GDF5调节乳腺癌MCF-7细胞中TGF依赖性血管生成：抗TGF肽的体内外控制

弗朗西丝卡·马格里等。 公共科学图书馆一号. 2012.

摘要

背景：肿瘤细胞过度生成TGF是肿瘤晚期进展的主要特征之一，与转移、肿瘤生长、血管生成和免疫反应有关。我们研究了抗TGF肽在控制TGF过表达条件诱导的血管生成中的治疗效果。

方法：我们将突变的TGFß基因插入人MCF7乳腺癌细胞的四环素可抑制载体中，以获得瞬时转染后成熟TGFé的条件表达，评估参与TGF依赖性内皮细胞激活的信号通路以及抗TGF肽在控制MCF7-TGF依赖的血管生成中的功效。

结果：TGFß在MCF7中过度表达诱导了上皮-间充质转化的几个标志物。TGFß转染的条件介质通过随后激活内皮细胞中的SMAD2/3和SMAD1/5信号以及SMAD4核转位，在体内外刺激血管生成，导致促血管生成生长和分化因子-5（GDF5）过度表达。TGF刺激的EC中GDF5的抑制或沉默导致GDF5表达受损和TGF依赖的尿激酶-前列腺素原激活物受体（uPAR）过度产生，导致血管生成障碍。两种不同的TGF拮抗肽抑制了外源性和条件表达的TGF在体内外诱发EC的所有血管生成相关特性，包括SMAD1/5磷酸化、SMAD4核转位、GDF5和uPAR过度表达。拮抗肽和抗GDF5抗体可有效抑制体内外血管生成。

结论：乳腺癌细胞产生的TGF诱导内皮细胞表达GDF5，进而刺激体内外血管生成。血管生成激活是迅速的，其相关机制与关于AKL5/ALK1平衡的古老且有争议的教条完全相反。TGF依赖GDF的促血管生成作用由抗TGF肽和抗GDF5抗体控制，为开展靶向临床研究提供了基础。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：Javier Dotor博士和Esperanza Feijoo博士首先设计了本研究中使用的抗TGF-β肽，他们作为纳瓦拉大学（西班牙）这家分拆公司的创始人，与本研究的商业资助者（DIGNA）有关联。本研究中使用的肽P144和P17（其特征详见参考文献37和38）均已获得DIGNA Biotech Company的专利，实际处于临床III期，用于局部硬皮病患者的局部使用，以治疗局部纤维化并防止其恶化。然而，这并没有改变作者对所有PLOS ONE数据和材料共享政策的遵守。。

数字

图1
图1。转染MCF7细胞中TGF的表达。TGF过度生成对MCF7细胞的影响。
面板A条件性中层蛋白印迹。MCFM:MCF7-转染假空载体；MCFTß：MCF7-转染突变的TGF-1编码序列。该图报告了4个复制品中的一个典型实验。右侧，分子量以kDa表示；Dx公司==================================================================多西环素。面板B.ELISA试剂盒在与A组相同的条件下测定MCF7培养基中TGF的浓度（4个不同的实验一式三份）。*p<0.05（学生t检验），与模拟有显著差异。面板C共聚焦显微镜显示波形蛋白、E-钙粘蛋白和N-钙粘蛋白在MCFM和MCFT中的分布。原始放大倍数：×60。面板D细胞裂解物的Western blot。在右边，分子量以kDa表示。Tubulin：加载控制。这些数字报告了4个复制品中的一个典型实验。面板E.使用WST-1试剂获得的%活细胞动力学。数据显示为在所报告的条件下进行的四次不同实验中获得的平均值±SD。面板F在Boyden小室试验中，MCFM和MCFTß细胞Matrigel侵袭。数据表示为侵入性细胞相对于未经处理的对照组的百分比变化，取100%±SD，由4个不同的实验三次获得。*p<0.05（学生t检验），与模拟有显著差异。面板GWestern blotting显示caspase激活。在右边，分子量以kDa表示。Tubulin：加载控制。该图报告了4个副本中的一个典型实验。
图2
图2。体外和体内MCF7-TGF诱导血管生成的评估。
面板AMVEC暴露于MCFTß或MCFM的CM中6小时。右上角的数字表示毛细血管丛的占野百分比（±SD），将在其自身培养基中培养的未经处理的MVEC视为100%。由于MVEC接种后6到18小时的总体形态没有实质性差异（除了通过毛细血管投影更好地定义小管形成外），因此在接种后6小时进行量化。图片显示了四个不同实验中的一个典型实验，得出了类似的结果。Dx：多西环素。面板A的底部图片显示了分别在p17（+p17）、p144（+p144）或扰乱寡肽（+scr）存在下暴露于Dx−/MCFT CM的MVEC的毛细血管形态发生。*p<0.05（学生t检验），与模拟有显著差异。面板B.上部：Matrigel海绵，含2.5×1064只小鼠在植入后5天恢复MCFT或MCFM，每只小鼠移植2种不同的海绵。在MCFTß存在下评估p17肽的抗血管生成活性。图中显示了系统给药（i.p.）肽后，4个不同实验中的一个典型实验，得出了类似结果。将p17与MCFTß共同注入塞子中，得到了类似的结果（未显示）。Dx：多西环素。下半部分：上半部分显示相同实验条件下海绵的CD31免疫组化。面板C左边：4个不同实验的移植样品中血红蛋白含量±SD与MCFM+Dx的比值为100%。右侧：相同条件下的%血管化±SD。*p<0.05（学生t检验），与相关对照组相比差异显著。
图3
图3。MVEC中ALK模式和SMAD1/2/3/5磷酸化的评估。
面板ART-PCR显示所用的3个MVEC细胞系上的ALK表达。GAPDH：加载控制。Bp显示在右侧。图片显示了3个复制品中的一个典型实验的结果。面板B。与GAPDH相关的ALK RNA定量。直方图显示了在每个MVEC细胞系上重复进行的3个不同实验的结果，±SD。*p<0.05（学生t检验），不同ALK RNA之间存在显著差异。面板C在P17存在或不存在的情况下，分别暴露于MCFM和MCFT CM 30分钟和120分钟的MVEC总蛋白提取物的蛋白质印迹。如图所示，对磷酸-SMAD1/5、SMAD5、磷酸-SMAD2/3和Tubulin（负荷控制）进行蛋白质印迹检测。分子量报告在右侧。同样在这种情况下，图片显示了3个复制品的典型实验结果。
图4
图4。SMAD4核移位。
左边的数字表示将MCFM和MCFTßCM添加到MVEC后经过的时间（小时）+P17：在存在TGF抑制肽P17的情况下获得的结果。数据显示了3个复制品中的一个典型实验，给出了类似的结果。
图5
图5。MVEC中TGF依赖性基因激活。
面板A用外源性添加的重组TGFß（1 ng/ml）刺激6 h MVEC后激活促血管生成基因。骨形态发生蛋白-7；GDF5，生长和分化因子-5。所示数据是在三个不同的实验中以两倍的形式获得的，用平均值±SD表示。*p<0.05（学生t检验）。面板B在无肽p17和有肽p17的情况下，用MCFM和MCFT细胞的CM刺激6 h MVEC后促血管生成基因的激活。白柱：在Dx−/MCFTß-CM刺激下，基因表达相对于MCFM-CM的倍数变化，假设值为1。灰色柱：与白色柱相同，有p17。所示数据是在三个不同的实验中以两倍的形式获得的，用平均值±SD表示。*使用MCFM CM获得的值p<0.05（学生t检验）；**在存在抑制肽的情况下，与Dx−/MCFTß-CM刺激有关，p<0.05。面板C对对照MVEC和用1 ng/ml TGFß刺激的MVEC中的GDF5和uPAR进行定量PCR。非靶向：非靶向siRNA；siGDF5，siRNA抗GDF5。*与非靶向siRNA获得的值相比，p<0.05（学生t检验）。面板D。在对照条件下（对照），并在用1 ng/ml TGF单独（TGF）、TGF+脂质体胺（lipo）、TGF+非靶向siRNA（siNT）和TGF+GDF5-靶向siRNA（siDGF5）刺激后，对MVEC裂解产物（100µg/条）进行Western blotting。主要抗体为抗GDF5 IgG和M2多克隆抗uPAR抗体。Tubulin，加载控制。分子量报告在右侧。
图6
图6。体内外TGFß/GDF5依赖性血管生成。
面板A.在对照MVEC（未经治疗）、MCFTßCM单独刺激以及在不相关的IgG（+不规则IgG）、5µg/ml抗GDF5抗体（抗-GDF5）、非靶向siRNA（siNT）、GDF5-靶向siRNA（siGDF5）、5μg/ml抗BM7抗体（抗BMP7）、BMP7-靶向si核糖核酸（siBMP7。面板B在小鼠Matrigel海绵模型中，siGDF5依赖性和抗GDF5抗体依赖性抑制血管生成的代表性实验。面板C左边：通过评估每个海绵的血红蛋白含量来量化海绵中的血管生成。右侧：相同条件下的%血管化±SD。使用蔡司SR-Stemi立体显微镜采集图像。TR：仅转染试剂；siNT：非靶向siRNA。结果是三个实验的平均值（每种条件三只动物，每只动物两个Matrigel海绵）。图表显示为平均值±SD；*单独转染试剂（TR）和非靶向siRNA（siNT）的p<0.05（学生t检验）。
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出版物类型

MeSH术语

赠款和资金

这项工作得到了托斯卡诺肿瘤研究所（ITT）和迪格纳生物技术公司（西班牙）的资助。资助者ITT在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。DIGNA Biotech参与了研究设计，因为来自DIGNA Biotech的作者E.Feijoo和J.Dotor参与了TGF-抑制剂的设计、生产和研究概念。