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.2012年11月2日；4(11):1139-56.
doi:10.3390/毒素4111139。

OTA和TNF-α诱导原代培养大鼠肝细胞凋亡及水飞蓟宾的预防作用

埃布蒂萨姆·埃西德 1, 尤瑟夫·德纳维, 恩斯特·佩钦格
附属公司

OTA和TNF-α诱导原代培养大鼠肝细胞凋亡及水飞蓟宾的预防作用

埃布蒂萨姆·埃西德等。 毒素（巴塞尔）. .

摘要

在原代大鼠肝细胞培养物中，应用20 ng/mL肿瘤坏死因子α（TNF-α）后发生凋亡。然而，这只是在存在200 ng/mL转录抑制剂放线菌素D（ActD）的情况下。在肝细胞培养上清液中存在25µg/mL可溶性TNF-α受体I（sTNFR I）时，这种毒性作用被完全阻止。施用12.5µmol/L赭曲霉毒素A（OTA）后也会发生细胞凋亡。然而，高达500µg/mL的sTNFR I并没有阻止这一现象，这表明TNF-α/TNFR I不参与OTA介导的肝细胞凋亡。130至260µmol/L剂量的抗氧化黄烷木聚糖水飞蓟宾可分别阻止OTA、10 mmol/L过氧化氢（H（2）O（2））和紫外线（UV-C）光（50 mJ/cm2）诱导的染色质凝聚、caspase-3活化和凋亡DNA断裂。为了实现水飞蓟宾的保护作用，提前2小时将药物应用于细胞培养物。正如丙二醛（MDA）的产生所揭示的那样，OTA刺激了培养的永生化大鼠肝HPCT细胞的脂质过氧化。H（2）O（2）和ActD/TNF-α孵育进一步发生脂质过氧化。水飞蓟宾预处理也抑制了这些反应。我们得出结论，水飞蓟宾对OTA、H（2）O（2）和ActD/TNF-α的抗凋亡活性是由黄烷木聚糖的抗氧化作用在体外引起的。此外，MTT试验显示了促凋亡毒素的细胞毒性。单独使用时，ActD和TNF-α在24小时后无细胞毒性作用，但如果联合使用则具有细胞毒性。使用的OTA、H（2）O（2）浓度和UV-C剂量在36 H内导致存活率大幅下降，这主要是由水飞蓟宾阻止的。我们得出结论，水飞蓟宾是一种有效的保护化合物，可对抗OTA和所研究化合物引起的细胞凋亡和细胞毒性。

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数字

图1
图1
OTA、ActD、TNF-α、H的细胞毒性2O（运行）2采用MTT试验检测不同浓度的(一)在线旅行社；(b条)行动D；(c（c）)仅TNF-α；(d日)ActD和TNF-α联合用药24小时；(e（电子）)H（H）2O（运行）2; 和(（f）)用UV-C照射。用五种不同的细胞制剂重复所有实验。数据表示平均值±SD(n个=每组5人）。第页与对照值相比，值*≤0.05、**≤0.01、***≤0.001被认为具有统计学意义。
图2
图2
水飞蓟宾对ActD/TNF-α，OTA，H的保护作用2O（运行）2以及UV-C介导的原代大鼠肝细胞培养中的细胞毒性。用水飞蓟宾在200/20 ng/mL ActD/TNF-α前2 h以260μmol/L预处理培养的原代大鼠肝细胞，在12.5μmool/L OTA、10 mmol/L h、2O（运行）2和50 mJ/cm2用五种不同的细胞制剂重复所有实验。数据表示平均值±SD(n个=每组5人）。第页数值：与对照值相比，*≤0.05，**≤0.01，***≤0.001具有统计学意义。
图3
图3
OTA、ActD/TNF-α、H激活caspase-32O（运行）2UV-C和水飞蓟宾预防。在12.5μmol/L OTA、10 mmol/L h和10 mmol/L OTA预处理培养的原代大鼠肝细胞2 h后，用Caspase-3/CPP32比色测定试剂盒测定Caspase-3活性2O（运行）2和50 mJ/cm2在200/20 ng/mL ActD/TNF-α作用12 h前2 h，UV-C和260μmol/L。用三种不同的细胞制剂重复所有实验。数据表示平均值±SD(n个=每组3人）。第页与对照值相比，值*≤0.05、**≤0.01、***≤0.001被认为具有统计学意义。
图4
图4
水飞蓟宾对OTA、ActD/TNF-α、H的保护作用2O（运行）2在12.5µmol/L OTA、200/20 ng/mL ActD/TNF-α、10 mmol/L h2O（运行）2和50 mJ/cm2UV-C持续24 h。培养细胞固定，染色质用Hoechst染色，并计数凋亡细胞核。(一)原代大鼠肝细胞（×400）Hoechst染色细胞核的荧光显微照片。白色箭头表示凋亡细胞核显示染色质碎片，而其他细胞核则完好无损。图片代表幻灯片中的至少五个字段；每个实验至少进行3次；(b条)凋亡细胞核的百分比作为凋亡指数给出。n个=3，使用单因素方差分析将治疗组与对照组进行比较。第页与对照值相比，值*≤0.05、**≤0.01、***≤0.001被认为具有统计学意义。
图5
图5
ActD/TNF-α对DNA阶梯的形成和水飞蓟宾的预防。处理原代大鼠肝细胞培养物(一)ActD 200 ng/mL、TNF-α20 ng/mL和ActD 200ng/mL，20 ng/mLTNF-；前三条通道显示出高分子、非片段化的DNA；或(b条)在200/20 ng/mL ActD/TNF-α之前2 h，用水飞蓟宾以增加的浓度进行预处理。然后，24小时后分离DNA并通过凝胶电泳进行可视化。用五种不同的细胞制剂重复所有实验。
图6
图6
OTA、ActD/TNF-α、H对DNA阶梯的发育2O（运行）2UV-C和水飞蓟宾预防。在12.5µmol/L OTA和10 mmol/L h之前2 h，用水飞蓟宾以130µmol/L的浓度预处理原代大鼠肝细胞2O（运行）2和50000µJ/cm2在200/20 ng/mL ActD/TNF-α前2 h，在260µmol/L的条件下。然后，在24小时后，分离DNA并通过凝胶电泳进行可视化。用五种不同的细胞制剂重复所有实验。
图7
图7
sTNFRI对OTA和ActD/TNF-α介导的DNA片段化的影响。在12.5µmol/L OTA前2小时，用500µg/mL的sTNFRI预处理原代大鼠肝细胞(一); 在200/20 ng/mL ActD/TNF-α前2 h，25µg/mL(b条). 然后，在24小时后，分离DNA并通过凝胶电泳进行可视化。用五种不同的细胞制剂重复所有实验。
图8
图8
水飞蓟宾对OTA、ActD/TNF-α和H诱导的氧化应激的影响2O（运行）2在50µmol/L OTA、200/20 ng/mL ActD/TNF-α和10 mmol/L h之前2 h用水飞蓟宾预处理HPCT-1E3细胞2O（运行）2然后，在6小时后，用荧光法测定脂质过氧化(一)用比色法测量ROS生成(b条). 用3种不同的细胞培养物重复所有实验。第页与对照值相比，值*≤0.05、**≤0.01、***≤0.001被认为具有统计学意义。
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