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.2013年1月11日；288(2):1079-87.
doi:10.1074/jbc。M112.421354。 Epub 2012年11月26日。

阻断c-Jun N末端激酶（JNK）向线粒体的移位可防止6-羟多巴胺诱导的体内外毒性

杰里米·钱伯斯 1, 香农霍华德, 菲利普·洛格拉索
附属公司

阻断c-Jun N末端激酶（JNK）向线粒体的移位可防止6-羟多巴胺诱导的体内外毒性

杰里米·钱伯斯等。 生物化学杂志. .

摘要

由于氧化应激和线粒体功能障碍是众所周知的帕金森病（PD）的促因，我们着手研究线粒体JNK在6-羟多巴胺诱导的氧化应激、线粒体功能障碍、，SHSY5Y细胞的神经毒性以及体内的神经保护和运动行为保护。为此，我们利用线粒体外膜蛋白的细胞可渗透肽Sab（SH3BP5）作为JNK线粒体易位的抑制剂。体外研究表明，6-OHDA诱导JNK向线粒体移位，Tat-Sab（KIM1）对线粒体JNK信号的抑制可防止6-OHDA引起的氧化应激、线粒体功能障碍和神经毒性。与只将6-OHDA注入黑质纹状体通路的动物相比，通过大脑中前脑束注射Tat-Sab（KIM1），6-OHDA损伤的动物黑质致密部酪氨酸羟化酶免疫反应神经元的数量增加了2倍（p<0.05）。此外，Tat-Sab（KIM1）使与损伤相关的d-安非他明诱导的单侧旋转减少30%（p<0.05）。第7天，Tat-Sab（KIM1）的大脑稳态水平为750 nm，这比该肽相对于Sab蛋白的IC（50）高约3.4倍。总的来说，这些数据表明6-OHDA诱导JNK易位到线粒体，阻断这种易位可以减少体内外的氧化应激、线粒体功能障碍和神经毒性。此外，数据表明，阻断JNK与线粒体结合的抑制剂可能是治疗帕金森病的有用神经保护剂。

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数字

图1。
图1。
6-OHDA激活SHSY5Y细胞中的JNK通路，并诱导JNK易位到线粒体。 A、，SHSY5Y细胞经25μ米6-OHDA作用4h，通过Western blot分析评估JNK信号。蛋白质（30μg）通过SDS-PAGE进行解析，并使用磷酸化MKK4、MKK 4、磷酸化JNK和JNK抗体检测全细胞裂解物中感兴趣的蛋白质。α-管蛋白被用作负荷控制。B、，用25μ米6-OHDA持续4 h。通过Western分析监测线粒体的JNK、phospho-JNK，MKK4、phosphal-MKK 4、MKK 7和phosphan-MKK7。COX-IV作为线粒体负荷控制。烯醇化酶、组蛋白H3和钙连蛋白印迹用于证明线粒体制剂的纯度。IB中，免疫印迹。
图2。
图2。
抑制线粒体JNK信号和JNK活性可防止6-OHDA诱导的SHSY5Y细胞氧化应激。 A、，SHSY5Y细胞经25μ米6-OHDA持续18 h，在有或无500 n的情况下测量归一化谷胱甘肽水平米SR-3306，10μ米Tat-Sab或Tat-scramble肽、JNK siRNA、Sab siRNA或对照siRNA。B、，与中相同A类除LPO外。C、，与中相同A类除测定了蛋白质羰基外。重要性(第页<0.05）6-OHDA治疗组和未治疗组之间用*表示，500 n之间米SR-3306，10μ米Tat-Sab或JNK siRNA或Sab siRNA和6-OHDA-处理组由**给出。结果来自至少三个生物复制实验，每个实验一式四份。
图3。
图3。
线粒体JNK信号传导和JNK活性的抑制可防止6-OHDA诱导的ROS生成、线粒体功能障碍以及SHSY5Y细胞中OCR和ATP水平的变化。 A、，SHSY5Y细胞经25μ米6-OHDA持续12 h，在存在或不存在50 n的情况下，通过归一化线粒体荧光测定线粒体ROS米SR-3306500牛顿米SR-3306，10μ米Tat-Sab或Tat-scramble肽、JNK siRNA、Sab siRNA或对照siRNA。B、，与中相同A类除线粒体膜电位在6-OHDA胁迫18h后用归一化JC-1荧光法测定外。C、，与中相同A类不同之处在于在6-OHDA应力12小时后在Seahorse XF-96分析仪中测量OCR。D中，与中相同A类; 6-OHDA应激12小时后，用ATP测定试剂盒（Invitrogen）监测ATP水平。重要性(第页<0.05）在6-OHDA治疗组和500n之间米SR-3306，10μ米Tat-Sab或JNK siRNA，或Sab siRNA和6-OHDA处理的基团用*.**表示，统计显著性(第页<0.05）。这些结果来自至少三个生物复制实验，每个实验都是一式四份进行的。
图4。
图4。
防止JNK线粒体易位和抑制JNK活性可防止6-OHDA诱导的SHSY5Y细胞的细胞毒性。 A类和B、，SHSY5Y细胞经25μ米6-OHDA作用4h，JNK在有或无5μ米通过Western blot分析评估Tat-Sab或Tat-scramble肽、JNK siRNA或Sab siRNA或对照siRNA。蛋白质（30μg）通过SDS-PAGE溶解，JNK抗体用于检测全细胞裂解物中感兴趣的蛋白质。COX-IV或GAPDH被用作负荷控制。C、，SHSY5Y细胞经25μ米6-OHDA持续4 h，在有或无500 n的情况下，24 h后通过TUNEL分析监测细胞死亡米SR-3306，10μ米Tat-Sab或Tat-scramble肽、JNK siRNA、Sab siRNA或对照siRNA。显著性(第页<0.05）在6-OHDA处理和500 n之间米SR-3306或10μ米Tat-Sab或JNK siRNA或Sab siRNA和6-OHDA-处理的基团由**.*给出，统计显著性(第页<0.05）。结果来自至少三个生物复制实验，每个实验一式四份。国际银行，免疫印迹。
图5。
图5。
防止JNK线粒体易位和抑制JNK活性可防止6-OHDA诱导的ROS生成、线粒体膜电位耗散和大鼠初级皮层神经元的细胞毒性。用25μ米6-OHDA持续12 h，在有或无500 n的情况下，通过归一化线粒体荧光测定线粒体ROS米SR-3306或10μ米Tat-Sab或Tat-scramble肽。B、，与中相同A类除线粒体膜电位在加入6-OHDA后18 h用归一化JC-1荧光测定外。C、，与中相同A类除了在添加6-OHDA后24小时通过TUNEL分析测定细胞死亡。重要性(第页<0.05）6-OHDA治疗组和未治疗组之间的剂量分别为*和500 n米SR-3306，10μ米Tat-Sab或JNK siRNA或Sab siRNA和6-OHDA-处理组由**给出。结果来自至少三个生物复制实验，每个实验一式四份。
图6。
图6。
预防JNK线粒体易位体内保护6-OHDA损伤大鼠SNpc中的多巴胺能神经元，并提供行为益处。 A、，6-OHDA治疗后7天SNpc中TH阳性细胞的无偏体视学计数。从bregma−4.4开始，在30μm处对约73个切片进行切片，并在bregma–6.6处结束。三组分析如下：生理盐水/生理盐水(萨尔+萨尔) (n个=5/组）；6-OHDA/生理盐水(n个=9/组）；和6-OHDA/42μg/kg Tat-Sab(n个=11/组）。将8μg 6-OHDA一次性注入内侧前脑束。对于Tat-Sab治疗组，在“实验程序”中给出的坐标下，在中脑前脑束内注射Tat-Sap。数据表示为TH的数量+通过TH-免疫组织化学（*，第页< 0.05; 通过单向方差分析建立，随后进行Tukey的事后检验）。B、，在SNpc中测量三组的总面积。C、，给受损大鼠注射d日-安非他明激发（5mg/kg，腹腔注射），测量旋转行为前10min。使用计算机化活动监测系统（*，第页< 0.05; 通过单向方差分析建立，随后进行Tukey的事后检验）。
图7。
图7。
TAMRA-Tat-Sab在SNpc中的分布。按照“实验程序”中的描述，以三次注射（脑室内注射）的方式给予总剂量为42μg/kg的Tat-Sab。注射后24小时处死动物，并在bregma−4.4和−6.6之间取30-μm切片。DAPI应用于每个切片，TAMRA荧光在Olympus DP70显微镜的Texas Red光谱通道上显示。
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