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.2012;7（11）：e49863。
doi:10.1371/journal.pone.0049863。 Epub 2012年11月16日。

二甲双胍降低控制能量代谢的线粒体脱乙酰酶SIRT3在肝脏的表达

马金·布勒 1, 桑纳·马里·阿钦基, 瓦莱里奥·伊齐, 朱卡·哈科拉
附属机构

二甲双胍降低控制能量代谢的线粒体脱乙酰酶SIRT3在肝脏的表达

马金·布勒等。 公共科学图书馆一号. 2012.

摘要

二甲双胍抑制线粒体中ATP的生成，这可能与药物的降血糖作用有关。Sirtuin 3（SIRT3）是一种线粒体蛋白脱乙酰酶，调节电子传递链的功能并维持基础ATP产量。我们假设二甲双胍治疗可以通过下调SIRT3的表达来减少线粒体ATP的生成。胰高血糖素和cAMP诱导小鼠原代肝细胞SIRT3 mRNA表达。二甲双胍阻止胰高血糖素诱导SIRT3。此外，二甲双胍下调了体内原代肝细胞和肝脏中SIRT3的组成性表达。雌激素相关受体α（ERRα）通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅活化因子1α（PGC-1α）介导Sirt3基因的调节。ERRαmRNA的表达与SIRT3 mRNA由胰高血糖素、cAMP和二甲双胍调节的方式类似。然而，与SIRT3相比，下调ERRα需要更高的二甲双胍浓度。ERRαsiRNA减弱PGC-1α介导的SIRT3诱导，但不影响组成性表达。组成活性形式的AMP-活化蛋白激酶（AMPK）的过度表达诱导了SIRT3 mRNA，表明二甲双胍对SIRT3的下调不是由AMPK介导的。二甲双胍降低肝细胞ATP水平。SIRT3过度表达部分抵消了这种影响。此外，二甲双胍降低了线粒体SIRT3蛋白水平，这与一些线粒体蛋白的乙酰化增强有关。然而，二甲双胍增加了肝细胞中的线粒体质量。总之，我们的结果表明，二甲双胍可减弱SIRT3的线粒体表达，并提示此机制与二甲双胍的肝脏能量代谢调节有关，可能有助于二甲双胍》的治疗作用。

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数字

图1
图1。SIRT3的表达受胰高血糖素、cAMP和二甲双胍的调节。
的影响A）胰高血糖素（5微克/毫升），B）cAMP（50µM 8-Br-cAMP）和C）胰高血糖素（5µg/ml）联合二甲双胍（1 mM）对小鼠原代肝细胞SIRT3表达的影响。在指定的时间点收集细胞，用qPCR测定SIRT3 mRNA的表达。D）按照指示用二甲双胍处理小鼠原代肝细胞，并在24小时后收集。用qPCR检测mRNA水平。在面板A-D中，数据表示为平均值+SD（n = 3). 对照样本的统计学显著性*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001（ANOVA，Bonferroni事后检验）。E）用1 mM二甲双胍处理小鼠原代肝细胞，按指示收集，并用qPCR测定mRNA水平。数值表示为平均值+SD（n = 4） 以及相对于每个时间点的未处理样本。独立计算SIRT3和SIRT1的统计显著性。SIRT3***P<0.001；SIRT1###P<0.001（方差分析，Bonferroni事后检验）。
图2
图2。ERRα参与二甲双胍对SIRT3的调节。
的影响A）胰高血糖素（5微克/毫升），B）cAMP（50µM 8-Br-cAMP）和C）胰高血糖素（5µg/ml）联合二甲双胍（1 mM）对小鼠原代肝细胞ERRα表达的影响。在指定的时间点收集细胞，用qPCR检测ERRαmRNA的表达。D）用二甲双胍处理小鼠原代肝细胞，24小时后收集，用qPCR检测mRNA。在面板A-D中，数据表示为平均值+SD（n = 3). 对照样本的统计显著性**P<0.01，***P<0.001（ANOVA，Bonferroni事后检验）。E）二甲双胍治疗对肝脏ERRα和SIRT3 mRNA表达的影响。小鼠（n = 7） 二甲双胍300mg/kg静脉滴注7天，每日1次，连续7天。对照动物只接受生理盐水。对照样本的统计显著性**P<0.01，***P<0.001（学生双尾t检验）。F）ERRαsiRNA对小鼠原代肝细胞SIRT3表达的影响。在MOI 0.1下使用腺病毒。数值表示平均值+SD，n = 3.数据表示相对于用干扰siRNA处理的样品的倍数变化，并且没有感染任何腺病毒。用星号表示腺病毒治疗的统计学显著效果，**P<0.01，***P<0.001（方差分析，Bonferroni事后检验）。与打乱siRNA相比，ERRαsiRNA处理的统计学显著效果用散列标记表示，#P<0.05，##P<0.01（学生双尾t检验）。G）AMPK对SIRT3和ERRα表达的影响。小鼠原代肝细胞感染AMPK-Ad或GFP-Ad（MOI = 2） 或未经治疗。在指定的时间点收集细胞，用qPCR测定mRNA表达。值表示平均值+标准偏差，n = 4.数据表示在给定时间点与未处理对照组相比的倍数变化。*与GFP-Ad（学生双尾t检验）相比，P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，具有统计学意义。
图3
图3。二甲双胍减少ATP合成和线粒体SIRT3表达，并影响线粒体乙酰化。
A）二甲双胍对细胞ATP水平的影响。用二甲双胍处理小鼠原代肝细胞，并在指定的时间点测量ATP水平。数据表示为平均值+SD（n = 12). 各时间点0 mM二甲双胍样本的统计显著性*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001（方差分析，Bonferroni事后检验）。B）用SIRT3质粒或pcDNA3对照质粒转染HepG2细胞24小时，再用3 mM二甲双胍处理24小时。然后收集细胞，测量ATP和ADP，并计算ATP/ADP比值。在每种情况下，数值都是相对于未经处理的样品（无SIRT3）给出的。数据表示为平均值+SD（n = 12). 对照样本的统计显著性（无SIRT3）*P<0.05，***P<0.001；二甲双胍处理的pcDNA3和SIRT3样本的统计学显著性差异#P<0.05，###P<0.001，（ANOVA，Bonferroni事后检验）。C）线粒体部分完整性评估。用1 mM二甲双胍处理小鼠原代肝细胞72小时。从相同样品中分离出细胞液和线粒体部分，并进行Western blot分析。D）二甲双胍影响SIRT3表达和线粒体蛋白乙酰化。图3C中相同线粒体组分的Western blot分析。上面板：抗SIRT3抗体免疫染色，中面板：抗乙酰赖氨酸抗体免疫染色和下面板：检测VDAC1作为负荷对照。闭合箭头表示二甲双胍治疗导致蛋白质乙酰化过度，开放箭头表示二甲苯治疗导致蛋白质去乙酰化。E）Western blot中SIRT3强度的定量如图3D所示（上面板）。带a和带b分别量化并归一化为VDAC1。
图4
图4。二甲双胍对肝线粒体生物发生的影响。
A）小鼠原代肝细胞在含有1mM二甲双胍的permanox Lab Tek 8孔室载玻片上培养48小时。用4%的PFA固定细胞，按说明进行免疫染色，并用DAPI荧光染料固定细胞。MTCO1呈绿色，细胞核呈蓝色。显示了具有代表性的图像。B）小鼠原代肝细胞全细胞裂解物的Western blot，用或不用二甲双胍孵育48小时。上面板：抗MTCO1免疫染色；下面板：检测β-actin作为负荷对照。C）HepG2细胞在含有3 mM二甲双胍的permanox Lab-Tek 8孔室载玻片上培养48小时，用Mitotracker Green FM（100 nM）培养1小时，并用含DAPI的Fluoroshield固定。线粒体呈绿色，细胞核呈蓝色。显示了具有代表性的图像。D）用3 mM二甲双胍处理HepG2细胞48小时后，用流式细胞仪（FACS）测量其线粒体质量，并用MitoTracker Green FM染色，通过荧光水平与未处理细胞进行比较。MFI（平均荧光强度）、ANOVA、Neuman–Keuls事后检验，***P<0.001。线粒体DNA相对水平E）在小鼠原代肝细胞中（n = 6） 二甲双胍治疗48小时，F）二甲双胍治疗7天（300mg/kg）的小鼠肝脏（对照n = 6，二甲双胍n = 7),G）HepG2细胞（n = 3） 用3 mM二甲双胍治疗24或48小时。在面板E-G中，*P<0.05，**P<0.01（学生单尾t检验）。
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出版物类型

MeSH术语

赠款和资金

本研究得到了欧盟（玛丽·居里RTN-NucSys）、芬兰科学院、Sigrid Juselius基金会、Oulu大学奖学金基金会和糖尿病研究基金会的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。