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.2012;7（11）：e49215。
doi:10.1371/journal.pone.0049215。 Epub 2012年11月13日。

过氧化氢对小鼠伤口愈合的影响及其与氧化损伤的关系

阿尔文·恩格·基亚特·鲁 1, Yee Ting Wong（王怡婷）, 何荣健, 马丁·瓦瑟, 杜铁华, Wee Thong Ng公司, 巴里·哈里维尔
附属公司

过氧化氢对小鼠伤口愈合的影响及其与氧化损伤的关系

阿尔文·恩格·基亚特·鲁等。 公共科学图书馆一号. 2012.

摘要

已经确定，伤口中会产生低浓度的过氧化氢（H（2）O（2）），这是最佳愈合所必需的。然而，与此同时，有证据表明过度氧化损伤与伤口愈合不良有关。在本文中，我们试图确定局部应用H（2）O（2）是否可以调节伤口愈合，以及其效果是否与氧化损伤有关。使用C57BL/6小鼠切除伤口模型，发现H（2）O（2）在10 mM时促进血管生成和伤口闭合，但在166 mM时延迟伤口闭合。闭合延迟还与结缔组织形成减少、MMP-8增加和持续中性粒细胞浸润有关。通过F（2）-异前列腺素和3-硝基酪氨酸检测，发现创伤会增加氧化脂质损伤和硝化蛋白损伤。然而，即使在延迟伤口愈合的浓度下，H（2）O（2）处理也不会显著增加氧化和硝化损伤。因此，H（2）O（2）的有害影响可能不涉及对所研究的目标分子的氧化损伤。

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数字

图1
图1。H的低浓度2O（运行）2促进伤口闭合，但高浓度it延迟伤口闭合。
（A） 在每只小鼠上创建四个全厚切除伤口，并在伤口上放置15µL的H2O（运行）2如图所示添加到伤口腔中。左侧面板是产生的伤口的代表性图片。右侧面板显示了H2O（运行）2涂抹在伤口上。（B） 不同浓度H的影响2O（运行）2伤口闭合率。在对6至8只小鼠实施安乐死之前，分别对其伤口大小进行6天和10天的监测。所示图表为汇总结果的平均值±标准误差。采用单因素方差分析分析伤口大小。166 mM H之间的差异2O（运行）2和对照组（p<0.05）或10 mM H2O（运行）2第6天时差异有统计学意义（p<0.01）。10 mM H之间的差异2O（运行）2在第8天和第10天，与对照组相比，差异有统计学意义（p<0.05）。10 mM和166 mM H之间的差异2O（运行）2在第8天也有统计学意义（p<0.05），但在第10天没有统计学意义。
图2
图2。高浓度的H2O（运行）2延缓结缔组织的形成。
按照材料和方法的描述，用Masson-Goldner三色染色法对第6天伤口的石蜡切片进行染色。结缔组织被染成绿色。纤维蛋白、焦痂和细胞质染成红色。细胞核染成深棕色。显示了对照（A，D）10 mM（B，E）和166 mM（C，F）治疗伤口的代表性图像。图像A-C放大100倍，而D-F放大200倍。（G） 量化着色为绿色的像素部分。使用定制软件量化放大100倍时，新生皮内染绿的像素数。量化的区域用虚线勾勒出来。结果采用单因素方差分析，然后采用Dunnett与对照组的多重比较试验进行分析。所示图表为平均值±S.E.M.n = 6-7，***p<0.001。
图3
图3。H的低浓度2O（运行）2增加伤口血管生成。
用免疫组织化学方法对第6天伤口的石蜡切片进行CD31染色。（A）对照（B）166 mM H的代表性显微照片2O（运行）2和（C）10 mM H2O（运行）2显示治疗过的伤口。（D） 采用单盲法计算新生皮内棕色管腔样结构的数量，并使用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett的对照多重比较试验进行分析。所示图表为平均值±S.E.M，n = 6-7，***p<0.001。
图4
图4。高浓度的H2O（运行）2增加伤口中MMP-8的水平。
伤后6天收集的伤口组织裂解物的Western blot分析。每条车道代表不同动物的样本。（A） MMP-8的代表性印迹。（B） 根据α-微管蛋白各自的印迹重新表达对MMP-8进行归一化的密度分析。结果为平均值±S.E.M.（n = 4） 使用单因素方差分析，然后对所有色谱柱进行Tukey多重比较。**p<0.01（C）MMP-9的代表性印迹。（D） 根据α-微管蛋白各自的印迹重新表达对MMP-9进行归一化的密度分析。结果为平均值±S.E.M.（n = 4） ，单向方差分析的p值为p = 0.13.
图5
图5。166毫米高2O（运行）2第1天和第6天伤口中性粒细胞浸润增加。
使用ImageJ量化新生皮的荧光强度。量化的区域用虚线勾勒出来。结果为平均值±S.E.M，n = 6-7. 每个处理的代表性部分如图所示。ES–Eschar；HE——超增殖表皮；ND–新生真皮。*p<0.05。
图6
图6。创伤增加ERK1/2和p38磷酸化，可进一步增加166 mM H2O（运行）2治疗。
（A） 伤后30分钟收集到伤口组织溶解物的典型斑点。皮肤是指非受伤动物的皮肤，而对照是指用PBS治疗的伤口。（B）磷酸化ERK和pan-ERK的密度，以及（C）磷酸化p38和pan p38的密度根据各自印迹中重新表达的α-微管蛋白进行了标准化。所示结果为平均值±S.E.M.（n = 4). 密度测定结果通过单因素方差分析进行分析，并使用Tukey的事后检验确定所有色谱柱之间的显著性检验。只有166 mM治疗的伤口和皮肤在B和C两种情况下的比较具有统计学意义。**p<0.01。
图7
图7。创伤增加脂质过氧化和硝化损伤，但不增加蛋白质羰基化。
F级2-通过对照花生四烯酸（A）或组织重量（B）恢复正常，比较皮肤和伤口中的异前列腺素水平。结果为平均值±S.E.M，n = 5.使用单因素方差分析和Dunnett的事后检验将伤口与皮肤进行比较。星号表示与皮肤相比的重要性级别。控制和H2O（运行）2使用双向方差分析对伤口进行比较，但差异无统计学意义。（C） 皮肤和伤口组织中花生四烯酸的水平。结果为平均值±S.E.M，n = 5.使用单因素方差分析和Dunnett的事后检验将伤口与皮肤进行比较。星号表示与皮肤相比的重要性级别。控制和H2O（运行）2使用双向方差分析对伤口进行比较，但差异无统计学意义。（D） 将伤口中的蛋白质羰基水平与完整皮肤进行比较，并以褶皱变化表示。结果显示，平均折叠变化±S.E.M.在对照伤口和166 mM H中未观察到蛋白质羰基水平的差异2O（运行）2治疗伤口。（E） 皮肤和伤口中3-硝基酪氨酸水平的比较。所示结果为平均值±S.E.M.，n = 5.将皮肤的3-硝基酪氨酸水平与对照伤口或H2O（运行）2对伤口进行治疗，并进行单因素方差分析，然后进行Dunnett的事后检验。伤后第6天3-硝基酪氨酸水平显著升高。对照组和166 mM H的3-硝基酪氨酸水平2O（运行）2用双向方差分析比较治疗后的伤口，差异无统计学意义*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
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