Re-evaluation of the role of calcium homeostasis endoplasmic reticulum protein (CHERP) in cellular calcium signaling

doi:10.1074/jbc.M112.405761

.2013年1月4日；288(1):355-67.

doi:10.1074/jbc。M112.405761。 Epub 2012年11月12日。

重新评估钙稳态内质网蛋白（CHERP）在细胞钙信号传导中的作用

林亚平Moshier¹, 彼得·塞巴斯蒂安, 利安·希金斯, 娜塔莉·桑普森, 简·E·休伊特, 乔纳森·马钱特

附属公司

PMID： 23148228
预防性维修识别码：项目经理3537033
内政部： 10.1074/jbc。M112.405761型

重新评估钙稳态内质网蛋白（CHERP）在细胞钙信号传导中的作用

亚平林莫舍等。生物化学杂志. 2013.

.2013年1月4日；288(1):355-67.

doi:10.1074/jbc。M112.405761。 Epub 2012年11月12日。

作者

亚平林莫舍¹, 彼得·塞巴斯蒂安, 利安·希金斯, 娜塔莉·桑普森, 简·E·休伊特, 乔纳森·马钱特

附属

¹美国明尼苏达州明尼阿波利斯市明尼苏打大学医学院药理学系，邮编55455。

PMID： 23148228
预防性维修识别码：项目经理3537033
内政部： 10.1074/jbc。M112.405761型

摘要

由内质网内细胞内Ca（2+）通道激活引起的细胞质Ca（2+）浓度的变化，调节细胞生长和分化的几个方面。Ca（2+）稳态内质网蛋白（CHERP）是一种广泛表达的蛋白质，被认为是内质网Ca（2+）通道、肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP（3）Rs）和ryanodine受体（RyRs）两大家族的调节器，对有丝分裂循环产生影响。然而，CHERP调节细胞内Ca（2+）通道以影响细胞生长的方式尚不清楚。在这里，我们对之前的研究结果提出质疑，即CHERP作为IP（3）Rs和RyRs的直接细胞质调节器，并提出CHERP通过调节U2 snRNA剪接体复合体的功能，在细胞核中影响细胞增殖。因此，先前报道的CHERP对细胞生长的影响可能是剪接体功能改变的间接影响，这与先前的数据一致，即U2 snRNP组分的功能丧失可能会干扰细胞生长并诱导细胞周期阻滞。

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数字

**图1。**
**抗CHERP抗体的验证。** A类，蛋白质印迹(*工作分解结构*)由HEK293细胞制备的WCL，在不存在CHERP抗体的情况下进行检测(左边)或存在碱性磷酸酶(*AP公司*,*正确的*). 斑点与抗肌动蛋白抗体共同孵育，作为负荷控制。B类，用于检测内源性和过表达CHERP构建体的HEK293 WCL样品的蛋白质印迹。用抗CHERP抗体检测样本(左边)然后用抗GFP抗体进行复制(*正确的*).实心箭头，GFP标记的CHERP；*开箭头*，内源性CHERP。C类用IgG免疫沉淀HEK293细胞制备的WCL样品的Western blot（抗CHERP）(左边)或CHERP抗体(*正确的*).D类,顶部双电荷单同位素前体615.316的代表性串联质谱米/*z（z）*在CHERP序列中与肽ITADGAHFELR匹配，质量准确度为1.4 ppm，肽置信度为99%。理论b条-和年-标记与实验产品离子峰匹配的类型片段离子类型（从ProteinPilot Viewer软件粘贴的光谱）。底部质谱检测121个独特肽的蛋白质覆盖率（54%）(*下划线的*序列），肽置信度≥95%。

**图2。**
**内源性CHERP蛋白的核分布。** *A、顶部*内源性CHERP的免疫细胞化学(红色)在HEK293中(左边)和SKBR3细胞(*正确的*). DAPI染色(蓝色)如所示*中间面板*，并作为合成合并图像(底部).B、，内源性CHERP的三重染色(红色)，急诊室(绿色)、和细胞核(蓝色)在HEK293细胞中。C类、用抗CHERP抗体检测的指示细胞系制备的细胞质和核组分的Western blot(顶部)和核标记（CREB，底部).D、，骨骼内源性CHERP蛋白的免疫荧光染色(底部)和心肌细胞(顶部).E、，CHERP的免疫定位(红色)，细胞核(蓝色)和类似ER(绿色)在大鼠心肌细胞中。*F、，*Western blots解析CHERP在心肌细胞和Jurkat细胞细胞质和核组分中的分布。*G、，*人工分离核中CHERP的Western blot爪蟾卵母细胞（共8个细胞核），与剩余细胞含量相比。图像显示孤立的细胞核(N个)在溶液中靠近一个完整的卵母细胞。*A中，*动物杆；*V、，*植物杆。

**图3。**
**CHERP基因家族的生物信息学注释。** A类，的示意图智人CHERP结构（NP_006378.3）显示特征注释，包括SURP域(圆圈)、CID(*灰色矩形*)，聚谷氨酰胺束(*黑色条*)，精氨酸/丝氨酸(*无线电*)-富裕地区(*深灰色矩形*)、和G补丁域(梯形). 使用保守域搜索工具注释蛋白质域（38）。先前注释的跨膜区域(*TM（TM）*)（8）如图所示*在上面*示意图，以及从PhosphoSite整理的发现模式质谱数据中确定的磷酸化位点(*小圆圈*). 预测NLS(星星)表示为NLS1（氨基酸726–742）、NLS2和-3（778–788/784–793）和NLS4（898–912）。B类，选定模型生物中假定CHERP同源物的系统发育树（BioNJ/TreeDyn）。CHERP的参考序列如下：智人（NP_006378.3），*小家鼠*（NP_613051.3），*褐家鼠*（XP_214307.2），*Gallus胆囊(*XP_001233544.1），*达尼奥雷里奥*（NP_956368.2），*黑腹角鲨*（第6部分，NP_001014589.1），以及*秀丽隐杆线虫*（标记65，NP_506386.1）。刻度表示支管长度。百分比定义了单个基因的氨基酸身份智人CHERP（NP_006378.3）。*C、，*上文定义的指定物种中CHERP蛋白的结构域概述。

**图4。**
**活细胞中CHERP的共焦成像。** *A中，*CHERP（1–916）-GFP与DAPI复染（0.1μg/ml，1 min）在HEK293细胞中的共定位(顶部)和SKBR3细胞(底部).B类，CHERP（1-916）-GFP靶向HEK293和SKBR3细胞的核亚结构域。亚核密度突出显示(箭头).C、，低浓度HEK293细胞内源性CHERP的染色(左边)和高倍放大(*正确的*). 如图所示，细胞与SC-35和DAPI共同染色。D类是核下病灶中CHERP的一个耐洗涤剂部分。左侧用编码Myc-CHERP的构建物瞬时转染HeLa细胞的免疫荧光图像，并在固定前用0.2%Triton预先提取。赖特免疫荧光图像与同一细胞的相控图像叠加。*E、，*瞬时转染Myc-CHERP结构体HeLa细胞的免疫荧光图像(左边)，内源性SC35共染色(*中间的*). 用洗涤剂预提取细胞后，显示出较大的CHERP病灶。覆盖(*正确的*)显示大多数但不是全部SC35-foci与CHERP foci重叠(*白色箭头*).盒限定在*下部面板。F、，*CHERP没有定位到Cajal尸体。下部(顶部)以及更高(底部)Myc-CHERP分布的免疫荧光图像(左边)和p80-coilin(*中间的*)在HeLa细胞中。合并的图像显示在*正确的。G公司*，用5,6-二氯-1-β处理的细胞-d日-呋喃核糖基苯并咪唑(*DRB（争议评审委员会）*) (100 μ米与未经处理的细胞相比，显示与SC35共定位的CHERP病灶扩大(顶部).

**图5。**
**CHERP截断突变体分析确定了负责核靶向的区域。** *A中，*CHERP截断变异体的示意图（图3中定义的符号A类). GFP部分没有用图形描述。B类，Western印迹(*工作分解结构*)由HEK293细胞制备的细胞质和核组分中，HEK292细胞转染了指示的CHERP截断突变体或GFP单独，并用GFP抗体检测(左边)或CREB抗体(*正确的*).C类共聚焦活细胞图像显示野生型CHERP（1–916）-GFP）（NH）的核定位₂-末端截短突变体（CHERP（342–916）-GFP）和COOH末端截短突变体（CHERP（1–725）-GFP）。D类，HEK293细胞共转染CHERP（1-725）-GFP和DsRed2-ER的代表性共焦图像，随后用DAPI染色(蓝色).E、顶部，代表性Western blot（GFP抗体），使用来自HEK293细胞的WCL样本（模拟转染与转染指定结构）证实外源CHERP蛋白的表达。底部，NH系列示意图₂-和CHERP的COOH末端截断突变体。F类，在HEK293细胞中表达的GFP标记CHERP截断结构的活细胞共焦图像。亲本GFP载体作为对照（GFP）。*G、，*共焦图像中CHERP结构分布的定量分析，在可比较的核和细胞质区域（*，对< 0.01).

**图6。**
**CHERP与核蛋白相互作用，包括SR140。** A类，基因本体注释(顶部、本地化；底部，功能）。B类，当几个质谱候选物的身份被提交到蛋白质相互作用组数据库时，预测了它们之间的关联（见“实验程序”）。联合免疫沉淀证实的相互作用如下所示黑线SF3B3是SF3B复合物中已知的合作伙伴，未在质谱数据集的最高严格级别进行鉴定，但在随后的免疫沉淀分析中进行了询问。*C、，*通过免疫共沉淀和蛋白质印迹对质谱候选物进行验证。左侧/*中间的*、蛋白质斑点(*工作分解结构*)用IgG免疫沉淀HEK293细胞制备的WCL样品（抗SR140和CHERP）(*左车道*)或CHERP抗体(*右车道*)如图所示。赖特，双荧光Western blot显示对照组和CHERP-GFP过度表达细胞中的CHERP和SR140抗体之间没有交叉反应。*D、，*SF3B3与CHERP的联合免疫沉淀。E类，代表性的Western blot结果显示CHERP(顶部)和SR140蛋白质水平(*中间的*)在模拟、扰乱和CHERP siRNA-转染的HEK293细胞中。β-肌动蛋白(*ACTB公司*)用作加载控件。*F、，*Western blotting结果的量化E类. *,对<0.01，模拟和干扰siRNA与CHERP siRNA的比较；#，对<0.01，模拟与干扰siRNA的比较。

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