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比较研究
.2012年12月28日;287(53):44645-53.
doi:10.1074/jbc。M112.423426。 Epub 2012年11月7日。

1-磷酸鞘氨醇(S1P)载体对内皮屏障的依赖性调节:与白蛋白-S1P相比,高密度脂蛋白(HDL)-S1P通过影响S1P1的水平、转运和信号传导延长内皮屏障的增强

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比较研究

1-磷酸鞘氨醇(S1P)载体对内皮屏障的依赖性调节:与白蛋白-S1P相比,高密度脂蛋白(HDL)-S1P通过影响S1P1的水平、转运和信号传导延长内皮屏障的增强

布伦特·A·威尔克森等。 生物化学杂志. .

摘要

1-磷酸鞘氨醇(S1P)是一种血载溶血磷脂,可促进内皮细胞(EC)屏障功能。在血浆中,S1P与高密度脂蛋白(HDL)和白蛋白相关,但尚不清楚载体是否对S1P信号传递产生不同影响。在此,我们确定HDL-S1P维持EC屏障的时间长于白蛋白S1P。我们表明,HDL-S1P的持续屏障效应依赖于S1P受体S1P1的信号传导,涉及Akt和内皮NOS(eNOS)的持续激活,以及下游NO靶点可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的活性。与白蛋白S1P相比,高密度脂蛋白-S1P治疗的总S1P1蛋白水平更高,且该效应与S1P1 mRNA增加无关,也不依赖于从头合成蛋白。一些证据表明,HDL-S1P的长期EC屏障增强活性是由于对S1P1贩运的特定影响。首先,与蛋白S1P处理的细胞相比,HDL-S1P处理细胞中蛋白酶体介导的S1P1降解速度较慢。其次,通过使用再循环阻滞剂莫能菌素治疗,HDL-S1P的长期屏障促进作用被消除。最后,与白蛋白S1P相比,HDL-S1P处理后,S1P1的细胞表面水平和富含小窝蛋白的微区中S1P1水平较高。总之,研究结果揭示了S1P载体对S1P1的特异性影响,并指出HDL是S1P1-PI3K-Akt-eNOS-sGC-依赖性EC屏障功能持续的生理介质。

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数字

图1。
图1。
HDL-S1P维持内皮屏障活性的时间长于白蛋白S1P。内皮细胞用HDL-S1P、白蛋白-S1P(每个含有150S1P)或无S1P车辆(无S1P). 一个,每个TEER轨迹是四个重复井的平均值。用HDL-S1P处理的井接收无脂肪酸血清白蛋白,用白蛋白-S1P处理的井接收HDL储存缓冲液,而对照井接收匹配体积的无脂肪酸血浆白蛋白和HDL储存缓冲器。Ω表示欧姆。B类显示了集成阻抗值(阻抗迹线下的面积),这是效应器的综合阻抗值除以指定时间段内控制代理的综合平均阻抗值。学生的t吨测试用于测试平均集成阻抗的显著差异。星号表明第页< 0.01.
图2。
图2。
HDL-S1P持续的内皮屏障活性依赖于涉及Akt激活的S1P1信号。 一个显示了内皮细胞经高密度脂蛋白-S1P、白蛋白-S1P(每种含150 n)处理约4小时后的ECIS分析S1P)或无S1P车辆(无S1P)然后是添加(箭头)S1P1拮抗剂W146(3.3μ)PI3K抑制剂LY294002(50 n)或车辆。这个星号表明HDL诱导的内皮细胞屏障水平显著降低(第页通过单向方差分析和Tukey的事后检验(α=0.05)确定S1P1拮抗后2 h内<0.0001)。所示的TEER轨迹表示每个治疗中2-3个重复井的平均归一化阻抗值。这些结果代表了至少三个独立实验的数据。Ω表示欧姆。B类C类,显示多重珠阵列分析,显示白蛋白S1P和HDL-S1P(150 n)的时间效应S1P)对Akt和ERK磷酸化的处理(p-AKT公司磷酸化细胞外信号调节激酶)分别是。左侧面板显示Akt/ERK中的平均折叠变化(n个=2)在5分钟、30分钟、3小时、4.5小时和6小时,相对于基线Akt/ERK水平,在每个时间点无S1P对照治疗中测得。右侧面板在所示的每个处理有3-4个重复6小时后,显示独立的Akt/ERK分析。星号表明Akt/ERK的重大变化(第页<0.05),通过单向方差分析和Tukey成对检验确定(α=0.05)。
图3。
图3。
HDL-S1P持续的内皮屏障活性依赖于eNOS活性。 一个内皮细胞经高密度脂蛋白-S1P、白蛋白-S1P处理3 h后的ECIS分析S1P)或无S1P的载体,然后添加eNOS抑制剂-名称(1-3 m)或车辆(箭头). 所示的每个TEER轨迹平均每个条件重复2-3次,并且代表了三个独立实验的数据。通过单因素方差分析和Tukey成对检验确定S1P刺激后8小时归一化阻抗的显著差异(α=0.05)。星号表明第页< 0.038. Ω表示欧姆。B类C类显示抗eNOS和磷酸化eNOS(p-eNOS型)(磷酸丝氨酸1177eNOS)免疫印迹分析在添加指示的效应物后6小时分离的内皮细胞提取物。中的绘图B类C类显示通过密度分析测定的eNOS和磷酸化eNOS蛋白水平的双重差异,并归一化为GAPDH水平。磷酸化eNOS和eNOS水平的显著差异通过单因素方差分析和Tukey配对试验确定(α=0.05)。alb-S1P,白蛋白-S1P。D类显示了内皮细胞经HDL-S1P处理3小时后的ECIS分析S1P),然后添加sGC抑制剂ODQ(30–3000 n)或车辆(箭头). 所示的每个TEER轨迹平均每个条件重复2-3次,并且代表了两个独立实验的数据。
图4。
图4。
与白蛋白S1P相比,HDP-S1P诱导S1P1水平的下降速度较慢。 一个用蛋白S1P处理0、2或6小时的内皮细胞提取物的抗S1P1免疫印迹分析(alb-S1P)或HDL-S1P(每个含有150 nS1P)。作为负荷控制,过滤器也用β-肌动蛋白抗血清进行检测。B类用白蛋白S1P或HDL-S1P处理内皮细胞6h的提取物的免疫印迹的密度分析。标绘值表示使用细胞色素氧化酶-IV标准化的实验复制品中的S1P1蛋白水平(COXIV公司)作为参考蛋白。学生的t吨检验(α=0.05)表明S1P1水平显著高于(第页=0.0129)与白蛋白S1P相比,HDL-S1P治疗后6 h。
图5。
图5。
与白蛋白S1P相比,HDL-S1P降低了S1P1降解率。 一个定量PCR分析内皮细胞中S1P1转录水平,用HDL-S1P、白蛋白S1P(每个含有150 n)处理内皮细胞S1P)或无S1P车辆6 h。B类,在用白蛋白-S1P或HDL-S1P(150 nS1P)。这个下部面板显示了所示时间间隔的集成阻抗值。通过将每个处理的集成阻抗值除以无S1P和无环己酰亚胺处理的细胞的平均集成阻抗值,得到这些值。Ω表示欧姆。C类用放线菌酮(0.5μg/ml)处理内皮细胞1h,然后用蛋白S1P处理长达6h的免疫印迹分析(alb-S1P)、HDL-S1P或无S1P车辆。细胞色素氧化酶-IV水平降低(舵手)随着时间的推移,表明环己酰亚胺在抑制从头开始合成。通过对来自四个实验的免疫印迹进行密度分析,测定3和6小时时的S1P1水平,如图中所示的印迹所示C类。绘制的值是HDL-S1P处理和白蛋白-S1P处理的细胞中S1P1相对于车辆处理对照中的S1P1水平的百分比(灰色). 这个第页使用单侧学生的t吨测试。D类用蛋白S1P、HDL-S1P或无S1P载体±蛋白酶体抑制剂MG132(20μ).
图6。
图6。
与白蛋白S1P相比,HDL-S1P处理后S1P1的细胞表面水平较高。 一个、用HDL-S1P、白蛋白-S1P(每个含有150 n)处理内皮细胞15 min后的抗S1P1免疫荧光分析S1P)或无S1P车辆。B类,共聚焦免疫荧光分析用HDL-S1P处理6 h的内皮细胞中的S1P1,白蛋白S1P(每个含有150 n)S1P)或无S1P车辆,并在图像上应用定量查找表。箭头指向S1P1丰富的单元格边框。C类用HDL-S1P或蛋白S1P处理3 h的内皮细胞生物素化细胞表面组分的抗S1P1免疫印迹分析S1P)。将每个样品中的密度测定S1P1值归一化为von Willebrand因子水平(vWF(vWF))并绘制图,以显示HDL-S1P处理细胞中表面S1P1水平相对于白蛋白-S1P处理细胞水平的倍数差异。绘制的数据包含两个独立实验的值。第页由单边单组学生的t吨与值1进行比较。D类在G蛋白偶联受体再循环抑制剂莫能菌素(285 n)的存在下,内皮细胞经±HDL-S1P处理后的ECIS分析)或车辆。Ω表示欧姆。E类,表示用无S1P处理的细胞的平均积分阻抗值除以3.5–6小时的时间间隔后的积分阻抗。这个第页值由学生的t吨测试。
图7。
图7。
与白蛋白S1P相比,HDL-S1P治疗增加了富含小窝蛋白-1的微域中S1P1的水平。在用HDL-S1P或白蛋白S1P(每个含有150 n)治疗3小时后制备提取物并进行密度梯度超速离心。从密度梯度的顶部(最低密度)到底部收集组分1-12,并使用抗S1P1和抗小窝蛋白-1进行免疫印迹分析。数据代表了两个实验。

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