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.2012;7（10）：e47862。
doi:10.1371/journal.pone.0047862。 Epub 2012年10月24日。

Sp1转录因子和GATA1顺式作用元件调节小鼠细胞周期蛋白A1的睾丸特异性表达

苏尼尔·帕尼格拉希 1, 安娜·瓦西列娃, 黛布拉·J·伍尔格茅斯
附属公司

Sp1转录因子和GATA1顺式作用元件调节小鼠细胞周期蛋白A1的睾丸特异性表达

苏尼尔·帕尼格拉希等。 公共科学图书馆一号. 2012.

摘要

细胞周期蛋白A1是一种男性生殖细胞特异性细胞周期调节因子，对精子发生至关重要。它在细胞周期蛋白中是独特的，因为它在体内的表达高度受限，存在于粗线期和二倍体精母细胞中，而不存在于精子发生的早期或晚期。为了了解小鼠细胞周期蛋白A1（Ccna1）基因表达窗口狭窄的分子机制，我们对其启动子进行了详细分析。我们在启动子中定义了一个170-bp区域，并表明它参与了培养细胞中Ccna1的抑制。在该区域内，我们确定了已知的顺式转录因子结合序列，包括一个Sp1结合位点和两个GATA1结合位点。Sp1和GATA1在粗线期精母细胞和生殖细胞分化后期均不表达。Sp1在精子发生的早期阶段很容易被检测到。定点突变表明，这两种因子都不足以显著抑制Ccna1启动子驱动的表达，而Sp1、GATA1和可能的其他因子的同时结合受到抑制。细胞系和精原细胞的ChIP分析证实了Sp1在Ccna1启动子上的占有率以及GATA1依赖性顺式作用元件的影响。与许多其他睾丸特异性基因相比，无论Ccna1是否具有转录活性，Ccnal启动子的CpG岛甲基化状态在所检测的各种组织中都是相似的，这表明这种调控机制并不参与Ccna1.的限制表达。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。5′缺失分析Ccna1公司启动子显示一个相对于转录起始位点（TSS）上游-120 bp的阻遏因子。
嵌合结构Ccna1公司启动子荧光素酶报告子在分类轴上以示意图表示。每个碎片的上游和下游端点都是相对于TSS的，由弯曲箭头表示。如方法部分所述，测试构建物在GC-4spc和NIH3T3细胞中的转录活性。pGL-Basic载体（其中不存在功能启动子）的荧光素酶活性设置为1.0，所有其他荧光素酶活性表示为pGL-Basec获得值的倍数。所有实验均一式四份，显示荧光素酶表达与独立实验的平均值±标准偏差。在所有实验中，pRL-CMV的荧光素酶活性，雷尼利亚以CMV启动子下表达的荧光素酶作为内部对照。
图2
图2。转录因子一致序列的鉴定Ccna1公司发起人。
使用哺乳动物转录因子数据库TRANSFAC（临界值为85）筛选−290/−100区域的结合位点。共识序列用虚线箭头下划线，GC框用矩形括起来。
图3
图3。的最小区域Ccna1公司蛋白质结合所必需的启动子位于位置内
−290/−120.（A） EMSA在pnd10睾丸和NIH3T3和GC-4spc细胞的核提取物（NE）中进行，这些细胞核提取物是用DNA探针孵育的Ccna1公司发起人。“无竞争”表示没有冷竞争对手的车道。对于竞争分析，在添加标记的−290/−120探针之前，将裂解产物与超过100倍的指示未标记DNA孵育。添加相同的未标记竞争物（车道−290/−120）后，仅与标记的−290/−120-探针反应时，DNA-蛋白质复合物的形成被完全消除。跨越−200/−120bp区域的寡核苷酸、包含GATA1结合位点的ds-寡核苷酸或包含Sp1连接位点的寡核苷酸没有或仅部分地与−290/−120探针竞争与转录因子的结合。箭头表示导致电泳迁移率改变的蛋白质-DNA复合物。（B） 来自抄送1启动子（位置−290至−120）与pnd10睾丸和GC-4spc细胞的核提取物（NE）孵育。添加抗Sp1抗体用“+”表示。箭头指向与抗体结合的Sp1-DNA探针复合物的超位移产物。
图4
图4。Sp1和可能的GATA1同时绑定到Ccna1公司启动子和抑制其活性体内.
（A） 使用放射性标记探针−290/−120 bp的Ccna 1号机组启动子显示特定的DNA-蛋白复合物形成（箭头）。通过添加100倍摩尔过量的含有完整Sp1位点的未标记DNA竞争对手，复合物的形成显著减少，而含有突变Sp1识别位点的冷竞争对手未能破坏结合。（B） 萤火虫荧光素酶报告子分析显示，与Sp1和GATA1位点结合可抑制Ccna1公司启动子（结构如左图所示）。Sp1和GATA1结合位点分别标记为开放椭圆和黑钻石。交叉（“X”）表示突变的结合位点。作为内部控制，pRL-CMV表达雷尼利亚CMV启动子下的荧光素酶在每次实验中被联合转染。条形图显示了三个独立实验的平均荧光素酶活性，根据雷尼利亚荧光素酶活性。
图5
图5。抑制SP1和GATA1表达导致上调Ccna1公司启动子活性。
用于转染的报告结构如左图所示。Sp1和GATA1结合位点分别用白色椭圆和黑色钻石标记。报告质粒和相应的siRNA寡核苷酸（100µM）被联合转染到NIH3T3和GC-4spc细胞中。在所有实验中，pRL-CMV被联合转染作为内部对照。条形图显示了五个独立实验的平均萤光素酶活性，相对于雷尼利亚荧光素酶活性。
图6
图6。通过ChIP分析鉴定蛋白质复合物表明Sp1和活性RNA聚合酶II与细胞特异性结合Ccna1公司启动子以及H3K27me3的富集。
使用Sp1、H3K27me3抗体或相应的IgG对照，从指定细胞或相当于106每个案例中的单元格。反向交联后，分离出结合DNA，并使用引物进行PCR，该引物扩增Ccna1公司启动子检测结合的Sp1和H3K27me3以及Ccna1公司启动子检测RNA聚合酶II结合。
图7
图7。组织特异性Ccna1公司表达不受差异启动子甲基化的调控。
（A） 总甲基化分析Ccna1公司组织和细胞系中的启动子如下：指定年龄的小鼠睾丸（T）、肾脏（K）、肝脏（L）、大脑（B）、心脏（H）、胰腺（P）、纯化粗线期细胞（Pac）、圆形精子细胞（Rnd）和细胞系GC-4spc（GC）、NIH3T3（NIH）。在每次分析中，500 ng总基因组DNA被分为四部分，分别用于模拟对照、甲基化敏感、甲基化依赖和双重消化。用甲基化敏感和不敏感核酸酶消化后，通过实时PCR的Ct值获得甲基化曲线Ccna1公司-CpG甲基化特异性引物。（B） 细胞表面单个CpG残基的甲基化状态Ccna1公司启动子经亚硫酸氢盐测序分析。将所示样品中的一微克DNA进行亚硫酸氢盐转化，然后使用针对Ccna1公司CpG岛。PCR产物克隆到pGEMTeasy载体中，测序，并用QUMA软件进行序列分析。体外CpG甲基化NIH3T3 DNA作为阳性对照，未转换序列的PCR扩增DNA作为阴性对照。非甲基化CpG用开圆表示。这个Ccna1公司具有CpG位置的启动子示意图。
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