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.2012年10月24日；32(43):15227-42.
doi:10.1523/JNEUROSCI.3545-12.2012。

α-突触核蛋白的系统诱变揭示了生理和病理活动的不同序列要求

杰奎琳·伯雷 1, 曼鲁·夏马, 托马斯·苏多夫
附属公司

α-突触核蛋白的系统诱变揭示了生理和病理活动的不同序列要求

杰奎琳·伯雷等。 神经科学. .

摘要

α-突触核蛋白是一种丰富的突触前蛋白，与磷脂和突触小泡结合。生理学上，α-突触核蛋白作为SNARE蛋白伴侣发挥作用，促进SNARE复合物组装以释放神经递质。病理学上，α-突触核蛋白突变和α-突触核蛋白过度表达会导致帕金森氏病，在多种神经退行性疾病（“突触核细胞病”）中，α-联核蛋白聚集体被发现为路易小体。α-突触核蛋白的生理功能与病理效应之间的关系尚不清楚。作为解决这个问题的最初途径，我们在这里系统地研究了α-突触核蛋白突变对其生理和病理活动的影响。我们生成了26个横跨整个分子的α-突触核蛋白突变体，并在7种分析中与野生型α-突触核蛋白进行了比较，这些分析包括纯化α-突变体的生化研究，以及培养神经元中α-突突核蛋白表达的分析，检测通过立体定向注射将病毒表达的α-突触核蛋白导入小鼠黑质的效果。我们发现，α-突触核蛋白的N端和C端序列都是作为SNARE-复合物伴侣发挥生理功能所必需的，但这些序列对其神经病理学作用并不重要。相反，α-突触核蛋白中心区域的点突变（称为非淀粉样β组分（残基61-95））以及与帕金森氏病相关的点变异（A30P、E46K和A53T）增加了α-突触核蛋白的神经毒性，但不影响其在SNARE复合物组装中的生理功能。因此，我们的数据表明，尽管α-突触核蛋白在某些情况下可以保护神经变性，但其生理功能与其神经病理学效应有根本区别，从而分离了α-突触核蛋白的两种活性。

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数字

图1。
图1。
α-突触核蛋白突变策略和实验方案。A类，突变策略。α-突触核蛋白的诱变旨在（1）在包含大多数α-突触核蛋白的11聚体序列中的保守位置引入脯氨酸残基，以打破介导α-突突核蛋白（红色）脂质结合的双亲螺旋；（2） 复制PD突变体（绿色）；（3）通过截断突变（黄色条）删除子域。B，纯化重组myc标记的WTα-突触核蛋白和α-突触体突变体（顶部，考马斯染色；底部，用c-myc抗体进行免疫印迹）。C类，实验方案。野生型和突变型α-突触核蛋白受到多种在体外和体内如图所示进行分析。
图2。
图2。
α-突变体与磷脂膜的结合。A类,B磷脂结合分析。用密度梯度离心法将含有WT和突变α-突触核蛋白的脂质体漂浮(A类). 基于脂质体在梯度中的分布(B)前两个组分1和2被定义为脂结合组分。C类在不含脂质体或不带电脂质体的情况下，BSA和α-突触核蛋白缺乏浮选，通过考马斯染色或用与α-突触核蛋白融合的myc表位抗体进行免疫印迹分析。D–F型，通过WT和突变的α-突触核蛋白定量磷脂结合。α-突触核蛋白点突变体的浮选(D类)和截断(E类)用脂质体作为前两个组分的总和进行定量，并绘制成梯度中总α-突触核蛋白的百分比(F类). 数据为平均值±SEM(**第页<0.01***第页<0.001（学生）t吨测试；n个=6–8个独立实验）。
图3。
图3。
突触靶向α-突触核蛋白突变体。A类,Bα-突触核蛋白在WT和synaptobrevin-2 KO（Syb2-KO）小鼠培养神经元中的突触定位(A类). 用内源性α-突触核蛋白（左，绿色）、内源性Syb2（右，绿色）和突触蛋白（红色）抗体对培养的神经元进行免疫染色。用皮尔逊系数定量配色(B).C–E类WT和突变α-突触核蛋白的突触定位。海马WT培养物在7 DIV感染表达WT的慢病毒和突变α-突触核蛋白，并在21 DIV使用c-myc（绿色）和突触蛋白（作为突触标记物，红色）抗体进行免疫染色。C类显示了WT和A30Pα-突触核蛋白的放大图像，以突出突触靶向的差异。使用Pearson系数对突触定位进行定量(E类). 注意，缺失突变体1-42和9-42没有表达。数据为平均值±SEM(*第页< 0.05, **第页<0.01***第页<0.001（学生）t吨测试；n个=3个独立的文化A类、和n个=7-9种独立文化D类).
图4。
图4。
α-突触核蛋白突变体结合突触肽-2。synaptobevin-2（Syb2）和myc标记的WTα-synuclein（α-Syn）和α-synuglein点突变体的DNA数量相等(A类)或α-突触核蛋白缺失突变体(B)共转染入HEK293T细胞。用免疫前血清（Pre-Imm.）或myc表位标签（IP）抗体免疫沉淀细胞裂解液中的α-突触核蛋白，并用突触素-2（Syb2）或α-突触素（α-Syn）抗体免疫印迹分析输入和免疫沉淀。
图5。
图5。
α-突触核蛋白突变对α-突触核蛋白介导的SNARE-复合物组装催化作用的影响，通过SNARE复合物的SDS抗性进行测量。A类,B在7DIV条件下，用过度表达WT和突变体α-突触核蛋白的慢病毒感染来自突触核三重KO（TKO）小鼠的培养神经元。在21 DIV时，采集神经元，测量SNARE复合物，作为SNAP-25的高分子质量带免疫反应性，沸腾后消失。α-突触核蛋白；Synt-1，syntaxin-1；Syb2、synaptobrevin-2。B，WT和突变α-突触核蛋白过度表达时SNARE-复合物组装的定量，标准化为对照水平。数据为平均值±SEM(*第页< 0.05, **第页<0.01***第页<0.001（学生）t吨测试；n个=3种独立文化）。
图6。
图6。
α-突触核蛋白突变对α-突触核蛋白介导的SNARE复合物组装催化作用的影响，通过SNARE蛋白联合免疫沉淀测定。A类,B图5所示的培养神经元在21 DIV时收获，SNARE复合物用syntaxin-1（Synt-1）抗体免疫沉淀。免疫印迹共免疫沉淀蛋白以检测SNAP-25和synaptobevin-2（Syb2）(A类). 对回收的蛋白质（相对于输入）进行量化，并将其归一化为免疫沉淀蛋白，然后达到控制水平(B). 数据为平均值±SEM(*第页< 0.05, **第页<0.01***第页<0.001（学生）t吨测试；n个=3种独立文化）。
图7。
图7。
野生型和突变型α-突触核蛋白的聚集倾向。A类,B，WT和突变α-突触核蛋白在HEK293T细胞中的表达。用编码WT和突变α-突触核蛋白的等量表达载体转染HEK细胞。转染后两天，用抗myc表位抗体的免疫印迹法分析表达水平(A类)并量化为WT水平的百分比(B).C–E类，转染HEK293T细胞中野生型和突变型α-突触核蛋白的聚集。转染后两天，细胞被固定，并用myc表位抗体进行免疫染色(C类,D类).C类显示放大的图像，以突出显示α-synuclein的WT（适度聚集）、1-95（聚集量最高）和42-140（聚集量最低）变体的聚集差异。单头箭头表示聚合。双头箭头表示没有聚合的区域。量化每个字段的免疫阳性聚集物数量，并与WT水平进行比较(E类). 中的数据B和E类为平均值±SEM(*第页< 0.05, **第页<0.01***第页<0.001（学生）t吨测试；n个=5种独立文化）。
图8。
图8。
将表达WT和突变α-突触核蛋白的慢病毒注射到致密部黑质中的小鼠运动缺陷。使用束流任务分析运动缺陷，在束流任务中测量束流上的脚滑。将表达WT或突变α-突触核蛋白的对照慢病毒（Control）或慢病毒立体定向和单侧注射到40–45天龄小鼠的黑质致密部，并在注射后45天每一疗程通过三轮束步对小鼠进行分析。记录了平均的脚步声。数据为平均值±SEM(*第页< 0.05, **第页<0.01（按学生）t吨测试；n个=4只小鼠）。
图9。
图9。
将表达WT和突变α-突触核蛋白的慢病毒注射到小鼠黑质中，对其运动功能进行钳板分析。A类，钳板分析的代表性痕迹。按照图8所示注射40–45天龄的WT小鼠，每5天监测一次，从注射后10天开始，直到注射后45天，然后对小鼠进行束走任务检查（图8）并处死进行组织化学分析。B根据多只相同注射小鼠获得的钳夹数据计算得出的低迁移率搏动（顶部）和空间限制（底部）分析。数据绘制为注射后第45天和第10天之间的差异。数据为平均值±SEM(*第页< 0.05, **第页<0.01（按学生）t吨测试；n个=4只小鼠）。
图10。
图10。
在黑质中表达α-突触核蛋白突变体的小鼠的神经元丢失。A类将表达WT或突变α-突触核蛋白的慢病毒（对照）或慢病毒立体定向和单侧注射到40–45天龄小鼠的黑质中。注射45天后，对注射区域进行TH（红色）或NeuN（红色）和DAPI（蓝色）免疫染色。IRES驱动的GFP标记注射部位。BTH（顶部）免疫染色定量多巴胺能神经元的密度，NeuN阳性（非多巴胺能）神经元的密度通过NeuN（底部）免疫染色量化。数据为平均值±SEM(*第页< 0.05, **第页<0.01（按学生）t吨测试；n个=4只小鼠）。
图11。
图11。
总结α-突触核蛋白突变对α-突触核蛋白功能和神经毒性活性的影响。A类，α-突触核蛋白结构域（顶部）和α-突触核蛋白区域（底部）的描述，这些区域介导α-突突核蛋白的神经毒性效应（红色）和生理SNARE-复合物组装功能（蓝色）。B，α-突触核蛋白突变对α-突触核蛋白功能和神经毒性活性的影响图，标准化为WTα-突触核蛋白的活性。根据脂质结合、突触靶向、突触蛋白-2结合和SNARE-复合物稳定的数据计算平均功能（图2-6）。从HEK细胞中的α-突触核蛋白聚集、走束上的脚踩、力板分析、多巴胺能神经元的损失和总神经元的损失的数据中获得平均病理学（图7-10）。有关详细信息，请参见材料和方法。
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