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.2012年12月15日；125（第24部分）：6094-104。
doi:10.1242/jcs.113019。 Epub 2012年10月17日。

组蛋白变体macroH2A标记体内胚胎分化，并作为诱导多能性的表观遗传屏障

文森特·帕斯克 1, Aliaksandra Radzisheuskaya公司, 阿斯特里德·吉利奇, 理查德·哈利·斯托特, 玛丽娜·帕纳马洛娃, 马格达莱娜·泽尔尼卡·戈茨, 阿齐姆·苏拉尼, 何塞·C·R·席尔瓦
附属公司

组蛋白变体macroH2A标记体内胚胎分化，并作为诱导多能性的表观遗传屏障

文森特·帕斯克等。 细胞科学杂志. .

摘要

体细胞分化过程中细胞命运如何受到限制是生物学中一个长期存在的问题。在胚胎发育过程中获得的多能干细胞中不存在的表观遗传机制有望稳定体细胞的分化状态，从而限制其转化为另一种命运的能力。组蛋白变体macroH2A作为表观遗传多层结构的一个组成部分，在遗传上维持沉默的X染色体，并已被证明限制肿瘤的发展。在这里，我们表明，macroH2A标志着小鼠胚胎发生期间的分化细胞状态。在内细胞团和外胚层建立多能性后，发现MacroH2A.1水平较低，但在小鼠发育后期的滋养层和分化的体细胞中高度富集。染色质免疫沉淀法显示，macroH2A.1存在于小鼠胚胎成纤维细胞和成年神经干细胞等体细胞中多能性基因调控区的染色质中，但不存在于胚胎干细胞中。去除宏H2A.1和/或宏H2A.2可将诱导多能性的效率提高25倍。获得的诱导多能干细胞重新激活了多能干基因，沉默了逆转录病毒转基因并有助于嵌合。此外，macroH2A亚型的过度表达阻止了外胚层干细胞的有效重编程，使其具有原始的多能性。总之，我们的研究首次确定了体细胞分化过程中表观遗传标记与细胞命运限制之间的联系，这有助于维持细胞特性并对抗多能干细胞状态的诱导。

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数字

图1。
图1。
MacroH2A.1在幼稚的多能外胚层中下调。(A类)E3.5雌性小鼠胚泡对macroH2A.1（合并面板中为红色）、Oct4（合并面板为蓝色）和Nanog（合并面板上为绿色）的全量免疫荧光。在滋养层细胞和ICM细胞（虚线）中检测到的核大分子H2A.1水平相当。请注意，幼稚的多能性尚未在ICM中确立。图像是投影共焦Z截面。(B类)E4.5雌性小鼠胚泡对macroH2A.1（合并面板中为红色）、Oct4（合并面板为蓝色）和Nanog（合并面板上为绿色）的整体免疫荧光。在滋养层细胞中检测到较高水平的核大分子H2A.1，在ICM（虚线）细胞中下调，这是在幼稚的多能性已经建立的阶段。图像是投影共焦Z截面。
图2。
图2。
MacroH2A.1在体细胞谱系发育过程中高度表达。(A类)E6.5女性X-GFP公司小鼠对macroH2A.1（合并面板中的红色）和GFP（合并面板中的绿色）进行全装配免疫荧光。MacroH2A.1在内脏内胚层（VE）和一定程度上在胚胎外外胚层（TE）中高度表达，但在所有体细胞谱系的前体细胞外胚层中未检测到X-GFP公司由于随机X染色体失活而表达）。DAPI为蓝色。图像是投影的共焦Z截面。(B类)ESCs、EpiSCs、NSC和MEF中macroH2A.1的Western blot分析。所有细胞均为雌性。Tubulin被用作负荷控制。(C类)在B.MacroH2A.1信号中显示的western blot分析定量被标准化为微管蛋白，ESCs水平设置为1。MacroH2A.1在ESCs中的表达最低，在EpiSCs、MEF和成年NSC中随着分化状态的增加而增加。(D类)E9.5母X-GFP公司小鼠胚胎对macroH2A.1（红色）和GFP（绿色）的整体免疫荧光。在此阶段，MacroH2A.1在胚胎的所有组织中表达。DAPI为蓝色。使用外荧光显微镜获得的图像。(E类)公式9.5X-GFP公司针对macroH2A.1（红色）和GFP（绿色）的小鼠胚胎免疫荧光显示了侧板中胚层的一部分（包括体节）。在所有体细胞中都检测到核宏H2A.1。马赛克X-GFP公司这种表达是由于随机X染色体失活所致。DAPI为蓝色。图像是投影共焦Z截面。比例尺：20µm。
图3。
图3。
MacroH2A.1标记分化细胞中受抑制多能性基因调控序列的染色质。MacroH2A.1多能性（ESCs，浅灰色）和体细胞（NSC，灰色；MEF，深灰色）中多能性和谱系特异性基因调控区的ChIP分析。DE，远端增强子；PE，近端增强子；PP，近端启动子；RR1，监管区域1；RR2，调节区2。误差条描述了s.e.m(n个===========================================================3). 如图所示，ESC与NSC或MEF之间存在显著差异*P（P）<0.05；t吨-测试一条尾巴，类型3。
图4。
图4。
MacroH2A是体细胞重编程到多能性的屏障。(A类)qRT-PCR分析稳定表达Scr shRNA、macroH2A.1 shRNA、microH2A.2 shRNA或macroH2A。误差线表示s.d(B类)实验装置示意图。在逆转录病毒介导的Oct4和Klf4表达后，从因子表达后3天起，在血清和LIF培养条件下，产生稳定的Oct4-GFP NSCs系，该系表达针对macroH2A.1、macroH2A.2或macroH2A.1和macroH2A.2的shRNA，或对照加扰序列（Scr）。(C类)MacroH2A缺失可提高重编程到多能性的效率。在macroH2A shRNA中表达Oct4和Klf4获得的Oct4-GFP阳性克隆10月4日-GFP在没有2i的情况下，用血清和LIF培养的神经干细胞。注意，在实验时间范围内，没有从诱导重新编程的shRNA-表达细胞中获得Oct4-GFP集落。逆转录病毒多能性基因表达24天后拍摄图像。(D类)重编程培养物的流式细胞术分析。显示了诱导核重编程24天后Oct4-GFP阳性细胞的比例（%总细胞）。以Oct4-GFP神经干细胞和Oct4-GFP胚胎干细胞为对照。结果代表了两个实验。(E类)根据Oct4-GFP阳性细胞的比例判断重编程效率。
图5。
图5。
MacroH2A敲除保留在获得的iPSC中。(A类)从重新编程的大分子H2A缺失的神经干细胞获得的iPSC的形态。(B类)qRT-PCR分析宏H2A.1和宏H2A.2在来源于macroH2A.1-或macroH2A2-depleted NSCs的NSCs、ESCs和iPSCs中的表达。宏H2A.1(宏H2A.1.1+宏H2A.1.2)为蓝色，macroH2A.2为紫色。误差线表示s.d(C类)shRNA NSC和macroH2A shRNA iPSCs中macroH2A.1的Western blot分析。组蛋白H3用作负荷对照。
图6。
图6。
大分子H2A缺失型多能干细胞的特性。(A类)逆转录病毒在NSC、NS-Pre-iPSC和来源于macroH2A.1或macroH2A.2 NSC的iPSC中表达的qRT-PCR分析。Klf4逆转录病毒（RetrKlf4）为蓝色，Oct4逆转录酶病毒（RetOct4）为红色(B类)缺失macroH2A的iPSCs的基因表达分析。来源于macroH2A.1或macroH2A.2 NSCs的NSCs、ESCs和iPSC中多能性基因表达的qRT-PCR分析。内源性Oct4（EndOct4）为蓝色，Rex1为红色，Klf4为紫色，Nanog为绿色。(C类)三个胚胎胚层的组织存在于来自表达多能干细胞的macroH2A.2 shRNA的畸胎瘤中。(D类)缺失大分子H2A的iPSCs对嵌合体小鼠的贡献。这些是在囊胚向C57/BL6囊胚注射macroH2A shRNA iPSCs后获得的。Agouti毛色表示嵌合体（箭头）。误差条表示s.d。
图7。
图7。
MacroH2A过度表达可阻止EpiSC的高效重编程，使其达到幼稚的多能性。(A类)实验装置示意图。Oct4-GFP EpiSCs转染编码载体纳克与宏H2A.1.s1,宏H2A.1.s2,宏H2A.1.s4,宏H2A.2或空载体控制，在双重选择下生长2周。在监测重组Oct4-GFP-阳性Epi-iPSCs的存在之前，选择的细胞以每孔50000个细胞的六孔板的密度进行培养，第二天切换到2i-plus LIF并再培养9天。(B类)具有Nanog和macroH2A变体或空载体过度表达的Oct4-GFP EpiSC的2i-plus LIF培养后9天拍摄的代表期和GFP图像。(C类)Oct4-GFP-阳性Epi-iPSCs菌落计数。显示了将macroH2A过度表达或对照细胞转换为2i+LIF条件后9天每孔10月4-GFP阳性Epi-iPSC的平均数量。值表示三个独立井的平均菌落数。(D类)qRT-PCR分析宏H2A.1（浅蓝色）和宏H2A.2（紫色）Oct4-GFP EpiSCs转染纳克（+Nanog）和宏H2A.1.s1（+.1.s1），宏H2A.1.s2（+1.s2），宏H2A.1.s4（+.1.s4），宏H2A.2（+.2）或空矢量控制（+empty）；以及在得到的Oct4-GFP表观iPSC以及对照Oct4-GFP ESCs中。(E类)qRT-PCR分析埃斯勒布（浅蓝色），雷克斯1（红色），10月4日（绿色）和Klf4公司（紫色）Oct4-GFP EpiSCs转染纳米（+Nanog）和宏H2A.1.s1（+.1.s1），宏H2A.1.s2（+.1.s2），宏H2A.1.s4（+.1.s4），宏H2A.2（+.2）或空矢量控制（+empty）；以及产生的Oct4-GFP Epi-iPSC和控制Oct4-GFP ESC。请注意控制Oct4-GFP ESCs表达Nanog，但不要过度表达Nanog。误差条表示s.d。
图8。
图8。
ESCs中MacroH2A过度表达。(A类)qRT-PCR分析宏H2A.1和宏H2A.2ESCs过度表达中的表达宏H2A.1.s1,宏H2A.1.s2,宏H2A.1.s4和宏H2A.2或空矢量控制。宏H2A.1为蓝色，并且宏观H2A.2紫色。(B类)qRT-PCR分析纳克,Klf4公司和埃斯勒布ESCs过度表达中的表达宏观H2A.1.s1,宏H2A.1.s2,宏H2A.1.s4和宏H2A.2或空矢量控制。纳米是蓝色的，Klf4公司红色和埃斯勒布绿色。(C类)qRT-PCR分析T-Brachyury公司和Gata4公司ESCs过度表达中的表达宏H2A.1.s1,宏H2A.1.s2,宏H2A.1.s4和宏H2A.2或空矢量控制。T-Brachyury公司为蓝色，并且Gata4公司紫色。误差线表示s.d。
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